Anreicherung nativer und rekombinanter extrazellulärer Vesikel von Mykobakterien

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Anreicherung nativer mykobakterieller extrazellulärer Vesikel (mEVs) aus axenischen Kulturen von Mycobacterium smegmatis (Msm) und wie mCherry (ein rot fluoreszierender Reporter) enthaltende rekombinante MsmEVs entworfen und angereichert werden können. Schließlich wird der neuartige Ansatz mit der Anreicherung von MsmEVs verifiziert, die das EsxA-Protein von Mycobacterium tuberculosis enthalten.

Zusammenfassung

Die meisten Bakterien, einschließlich Mykobakterien, erzeugen extrazelluläre Vesikel (EVs). Da bakterielle EVs (bEVs) eine Untergruppe zellulärer Komponenten enthalten, darunter Metaboliten, Lipide, Proteine und Nukleinsäuren, haben mehrere Gruppen entweder die native oder die rekombinante Version von bEVs auf ihre schützende Wirksamkeit als Impfstoffkandidaten für Untereinheiten untersucht. Im Gegensatz zu nativen EVs sind rekombinante EVs molekular so konstruiert, dass sie ein oder mehrere Immunogene von Interesse enthalten. In den letzten zehn Jahren haben verschiedene Gruppen verschiedene Ansätze zur Erzeugung rekombinanter bEVs erforscht. Hier berichten wir jedoch über das Design, die Konstruktion und die Anreicherung von rekombinanten mykobakteriellen EVs (mEVs) in Mykobakterien. Zu diesem Zweck verwenden wir Mycobacterium smegmatis (Msm), ein avirulentes Bodenmykobakterium, als Modellsystem. Wir beschreiben zunächst die Generierung und Anreicherung nativer Elektrofahrzeuge von MSM. Anschließend beschreiben wir das Design und die Konstruktion von rekombinanten mEVs, die entweder mCherry, ein rot fluoreszierendes Reporterprotein, oder EsxA (Esat-6), ein prominentes Immunogen von Mycobacterium tuberculosis, enthalten. Dies erreichen wir, indem wir mCherry- und EsxA-N-Termini separat mit dem C-Terminus eines kleinen Msm-Proteins Cfp-29 fusionieren. Cfp-29 ist eines der wenigen Proteine, die in MsmEVs reichlich vorhanden sind. Das Protokoll zur Erzeugung und Anreicherung rekombinanter mEVs aus Msm bleibt identisch mit der Generierung und Anreicherung nativer EVs von MSM.

Einleitung

Trotz der Entwicklung und Verabreichung einer breiten Palette von Impfstoffen gegen Infektionskrankheiten ereignen sich auch heute noch ~30% aller Todesfälle beim Menschen durch übertragbare Krankheiten¹. Vor dem Aufkommen des Tuberkulose-Impfstoffs - Bacillus Calmette Guerin (BCG) - war Tuberkulose die häufigste Todesursache (~10.000 bis 15.000/100.000 Einwohner)². Mit der Verabreichung von BCG und dem einfachen Zugang zu Erst- und Zweitlinienmedikamenten gegen Tuberkulose sind die TB-bedingten Todesfälle bis 2022 dramatisch auf ~1 Million/Jahr bis 2022 gesunken (d. h. ~15-20/100.000 Einwohner¹). In den TB-endemischen Populationen der Welt liegt die Zahl der TB-bedingten Todesfälle jedoch weiterhin bei ~100-550/100.000 Einwohnern¹. Während Experten mehrere Gründe erkennen, die zu diesen verzerrten Zahlen führen, scheint der BCG-vermittelte Schutz, der nicht einmal im ersten Lebensjahrzehnt anhält, der Hauptgrund dafür zu sein 3,4,5,6,7. Angesichts der erneuerten "Ziele für nachhaltige Entwicklung" der Vereinten Nationen und der "Strategie zur Beendigung der Tuberkulose" der WHO gibt es daher konzertierte globale Anstrengungen, um eine viel bessere Impfstoffalternative zu BCG zu entwickeln, die möglicherweise einen lebenslangen Schutz vor Tuberkulose bietet.

Um dieses Ziel zu erreichen, evaluieren mehrere Gruppen derzeit modifizierte/rekombinante BCG-Stämme, nicht-pathogene und abgeschwächte Mykobakterienspezies außer BCG und Untereinheitenkandidaten 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Typischerweise handelt es sich bei Subunit-Impfstoffen um Liposomen, die selektiv mit wenigen gereinigten (~1-6) vollständigen (~1-6) immunogenen Proteinen des Erregers beladen sind. Aufgrund ihrer unechten Faltung in nicht-native Konformationen und/oder zufälliger nicht-funktionaler Interaktionen zwischen den beladenen Proteinen fehlen den Untereinheiten jedoch oft native und germane Epitope und sie können das Immunsystem daher nicht ausreichend vorbereiten^14,19,20.

Folglich haben extrazelluläre Vesikel (EVs) von Bakterien als vielversprechende Alternative an Fahrt aufgenommen 21,22,23,24,25,26. Typischerweise enthalten bakterielle EVs (bEVs) eine Teilmenge ihrer zellulären Bestandteile, darunter einige Teile von Nukleinsäuren, Lipiden und Hunderten von Metaboliten und Proteinen^27,28. Im Gegensatz zu Liposomen, bei denen einige wenige gereinigte Proteine künstlich geladen werden, enthalten bEVs Hunderte von natürlich beladenen, nativ gefalteten Proteinen mit einer besseren Neigung, das Immunsystem vorzubereiten, insbesondere ohne den Schub/die Hilfe von Adjuvantien und Toll-like-Rezeptoren (TLR)-Agonisten^27,28,29. In dieser Forschungsrichtung haben wir und andere den Nutzen von mykobakteriellen EVs als potenzielle Untereinheiten-Booster für BCG³⁰ untersucht. Trotz der Befürchtungen, dass bEVs keine einheitlichen Antigenlasten aufweisen, haben EVs aus abgeschwächter Neisseria meningitidis den Menschen erfolgreich vor Meningokokken der Serogruppe B geschützt^31,32.

Zumindest theoretisch sind die besten EVs, die BCG gut steigern könnten, die EVs, die mit pathogenen Bakterien angereichert sind. Die Anreicherung von Elektrofahrzeugen, die durch pathogene Mykobakterien erzeugt werden, ist jedoch teuer, zeitaufwändig und riskant. Darüber hinaus können durch Krankheitserreger erzeugte EVs virulenter als schützend sein. Angesichts der potenziellen Risiken berichten wir hier über ein gut getestetes Protokoll zur Anreicherung von Elektrofahrzeugen, die durch axenisch gezüchtetes MSM, ein avirulentes Mykobakterium, erzeugt werden.

Trotz der Kodierung mehrerer pathogener Proteinorthologe fehlen avirulenten Mykobakterien jedoch mehrere Impfantigene/pathogene Proteinepitope, die notwendig sind, um das Immunsystem ausreichend auf den Schutz vorzubereiten³³. Daher untersuchten wir auch die Konstruktion und Anreicherung rekombinanter EVs von Msm durch molekulares Engineering, so dass ein signifikanter Teil jedes pathogenen Proteins von Interesse, das in Msm exprimiert und translatiert wird, seine EVs erreichen muss. Wir stellten die Hypothese auf, dass eines oder mehrere der 10 am häufigsten vorkommenden Proteine von MSM EVs, wenn sie mit dem interessierenden Protein fusioniert werden, bei einer solchen Translokation helfen.

Während wir 2011 begannen, die Anreicherung von mykobakteriellen EVs (mEVs) in unserem Labor zu standardisieren, berichteten Prados-Rosales et al. erstmals über die Visualisierung und Anreicherung von mEVs in vitro³⁰. Später, im Jahr 2014, veröffentlichte dieselbe Gruppe eine modifizierte Version ihrer Methode³⁴ aus dem Jahr 2011. Im Jahr 2015 berichteten Lee et al. auch über eine unabhängig standardisierte Methode zur mEV-Anreicherung, wiederum aus axenischen Kulturen von Mykobakterien³⁵. Durch die Kombination beider Protokolle 34,35 und die Einbeziehung einiger unserer Modifikationen nach gründlicher Standardisierung beschreiben wir hier ein Protokoll^, das bei der routinemäßigen Anreicherung von mEVs aus axenischen Kulturen von Mykobakterien^{hilft 36}.

Hier gehen wir besonders auf die Anreicherung von MSM-spezifischen EVs ein, die eine Erweiterung eines veröffentlichten Protokolls³⁶ für die Anreicherung von mykobakteriellen EVs im Allgemeinen darstellt. Wir beschreiben auch, wie rekombinante mEVs (R-mEVs) konstruiert werden können, die das mCherry-Protein (als rot fluoreszierender Reporter) und EsxA (Esat-6)^37,38,39 enthalten, ein vorherrschendes Immunogen und eine potenzielle Untereinheit des Vaccinogens von Mycobacterium tuberculosis. Das Protokoll für die Anreicherung der R-mEVs bleibt identisch mit dem, das wir für die Anreicherung nativer EVs von MSM beschrieben haben.

Protokoll

1. Wachstumsbedingungen von Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli und ihren Derivaten

1. Medien
   1. Middlebrook 7H9 flüssige Brühe
      1. Bereiten Sie 20%ige Tween-80-Stammlösung vor, indem Sie das erforderliche Volumen des doppelt destillierten Wassers (ddw) in einem Glasbecherglas in einer Mikrowelle auf ~45-50 ^°C vorwärmen, das erforderliche Volumen Tween-80 mit einem geeigneten Messzylinder hinzufügen und kontinuierlich auf einem kleinen Magnetrührer rühren, um die 20%igen Tween-80 in eine gleichmäßige Lösung zu bringen. Das 20%ige Tween-80 wird durch einen 0,22 μm Entsorgungsfilter filtriert und die blassgelbe Stammlösung bei 4 ^°C gelagert.
         HINWEIS: Alle Spuren von Tween-80 im Messzylinder müssen in das Becherglas übertragen werden, um eine genaue Endkonzentration zu erhalten. Autoklavieren Sie das vorbereitete Tween-80-Material nicht. Filter (0,22 μM verwenden) sterilisieren und bei 4 ^°C lagern.
      2. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für die Zubereitung der 7H9-Brühe. 4,7 g 7H9-Pulver werden in 900 ml ddw suspendiert. Fügen Sie 2 ml Glycerin hinzu, mischen Sie den Inhalt und autoklavieren Sie bei 121 ^°C, 15 psi für 20 Minuten.
         HINWEIS: Fügen Sie Middlebrook ADC Enrichment (ADC) und Tween-80 nicht vor dem Autoklavieren hinzu.
      3. Nachdem das autoklavierte Medium auf Raumtemperatur (RT, d. h. ~25 ^°C) abgekühlt ist, wird in einer Standard-Biosicherheitswerkbank vom Typ A2 aseptisch 10x 100 ml ADC (1x endgültig) und 2,5 ml (letzte 0,05 %) 20 % Tween-80 zugegeben. Filtrieren Sie das Gemisch durch eine 0,22 μm Einwegfiltereinheit und lagern Sie die sehr hell gelblich-grüne, transparente Stammlösung bei 4 ^°C.
         HINWEIS: Der pH-Wert des Mediums muss ~6,6 bis 6,8 betragen (bei <6,4 oder >7,0 entsorgen und frisch machen). Bei 4 ^°C lagern (3-4 Wochen haltbar). Es wird dringend empfohlen, das 7H9-Medium (nach Zugabe von ADC und Tween-80) zweimal durch zwei unabhängige 0,22-μm-Einwegfiltereinheiten zu filtern.
   2. Sauton's (Minimal Media) flüssige Brühe
      1. L-Asparagin (0,4 % w/v) und Zitronensäure (0,2 % w/v) in 950 ml ddw lösen. Fügen Sie je 1 ml frisch zubereitete 1.000-fache Brühe (in ddw) dibasisches Kaliumphosphat hinzu (farblos; Brühe 10 g/20 ml; endgültig 1x 0,5 g/l); Magnesiumsulfat-Heptahydrat (farblos; Stamm 10 g/20 ml; endgültig 1x 0,5 g/l); und Eisen(III.-Ammoniumcitrat) (sehr hellbraun; Stamm 1,6 g/40 ml; endgültig 1x 0,04 g/L) und auf einem Magnetrührer gut umrühren.
         HINWEIS: Im besten Fall können die 1.000-fachen Aktien 2 Wochen alt sein; wenn älter, bereiten Sie frische Vorräte vor; Lagern Sie sie bei RT im Dunkeln (z. B. in einem Schrank/Regal). Wenn das Eisen-Ammoniumcitrat dunkelbraun ist, entsorgen Sie es und machen Sie es frisch. Am besten fügen Sie die drei Salze in der in Schritt 1.1.2.1 genannten Reihenfolge hinzu. Schwenken Sie die Lösung jedes Mal, bevor Sie jede Salzlösung hinzufügen.
      2. Messen und notieren Sie den pH-Wert mit einem pH-Messgerät; Stellen Sie sicher, dass sie zwischen 3,1 und 3,2 liegt. Wenn der pH-Wert über 3,7 liegt, die Brühen wegwerfen und frisch zubereiten. Um den pH-Wert auf 7,4 einzustellen, verwenden Sie so viele Tropfen 10 N Natriumhydroxid wie nötig. Überwachen Sie den endgültigen pH-Wert, während Sie die Lösung/das Medium kontinuierlich auf einem Magnetrührer umrühren.
      3. Man fügt 4,76 ml Glycerin und 0,25 ml 20 % Tween-80 (endgültige 0,005 %, siehe auch die Anmerkung zu Schritt 2.2.1.3) hinzu und füllt erst dann das Volumen auf 1 l auf. Filtersterilisieren Sie dann das Doppelte des 1-Liter-Mediums mit zwei separaten 0,22-μm-Entsorgungsfiltern. Lagern Sie das klare, farblose Medium bei 4 ^°C (2 Wochen haltbar).
         HINWEIS: Erst nachdem der pH-Wert auf 7,4 eingestellt ist, fügen Sie Glycerin hinzu. Andernfalls werden die Medien bewölkt weiß. Wenn es trüb ist, entsorgen Sie es (versuchen Sie nicht, es zu erhitzen) und bereiten Sie es frisch zu. Verwenden Sie für alle mEV-Zubereitungen frisch zubereitete Sauton's.
   3. Middlebrook 7H11 Agar-Basis
      1. Befolgen Sie die Zubereitungsanweisungen des Herstellers. Suspendieren Sie 19 g 7H11-Pulver in 900 ml ddw. 5 ml Glycerin hinzufügen, auf einem Magnetrührer schwenken, um eine gleichmäßige Suspension zu erhalten (hellgrün; pH 6,6 bis 6,8; wenn >7,2; verwerfen und frisch zubereiten) und bei 121 ^°C, 15 psi und 20 Minuten lang autoklavieren.
         HINWEIS: ADC und 0,05 % Tween-80 vor dem Autoklavieren nicht hinzufügen.
      2. Wenn das Medium auf ~50 ^°C abgekühlt ist, werden aseptisch in einer Biosicherheitswerkbank vom Typ A2 100 ml ADC (RT) und 2,5 ml 20 % (endgültige 0,05 %) Tween-80 (RT) zugegeben. Sofort aseptisch in Petrischalen dosieren.
         HINWEIS: Die Platten sind bei 4 ^°C für mindestens 4-6 Wochen stabil. Stellen Sie sicher, dass die Platten über Nacht auf RT sind, bevor Sie die Platten für die Lagerung bei 4 ^°C einwickeln. Andernfalls wird während der Inkubation bei 37 ^°C Feuchtigkeit in den Platten eingeschlossen.
   4. Miller Luria Bertani (LB) Brühe und Agar-Basis
      1. Befolgen Sie die Zubereitungsanweisungen des Herstellers. Zur Zubereitung von LB-Brühe 25 g Pulver in 1.000 ml ddw suspendieren und 5 Minuten lang in einem Glasbecherglas auf einem Magnetrührer vorsichtig umrühren. Nach gleichmäßiger Suspension werden die erforderlichen Volumina in Medienflaschen (z. B. 300 ml in einer 500-ml-Medienflasche) aliquotiert und autoklaviert. Zur Herstellung von LB-Agar werden 40 g Pulver in 1.000 ml ddw suspendiert und autoklaviert (12 g Pulver in 300 ml ddw in einer 500-ml-Glasmedienflasche).
2. Wachstumsbedingungen
   HINWEIS: Alle Schritte der Bakterienkulturarbeit müssen in einer Biosicherheitswerkbank (Typ A2) durchgeführt werden. Alle Kulturen müssen mit sterilen Röhrchen, Kolben und Pipettenspitzen verarbeitet werden.
   1. Tag 1
      1. Fügen Sie je 1 ml Glycerinbrühe von Msm (aus dem Gefrierschrank von -80 °C) zu 2 x 10 ml (in sterilen konischen 50-ml-Zentrifugenröhrchen) frisch autoklavierter, gekühlter und vorgewärmter (~37 °C) 7H9-Brühe hinzu, schwenken Sie sie dreimal, schließen Sie die Deckel und inkubieren Sie die Röhrchen über Nacht bei 37 ^°C und 200-220 U/min (Inkubatorschüttler).
         HINWEIS: Um Mycobacterium tuberculosis (Mtb) zu züchten, befolgen Sie ähnliche Schritte, aber inkubieren Sie die 50-ml-Röhrchen 4-6 Tage lang bei 37 ^°C und 120-150 U/min (Inkubatorschüttler) in BSL3-Einstellungen. Befolgen Sie ALLE internationalen Richtlinien und Biosicherheitspraktiken für BSL3- und Risikogruppen-3-Krankheitserreger beim Umgang mit und der Entsorgung von Mtb und seinen Kulturen. Verwenden Sie die Biosicherheitswerkbank vom Typ B2 für den Umgang mit Mtb und seinen Kulturen.
   2. Tag 2
      1. Wenn OD 600 (A_{600 nm}; Zelldensitometer) ~1,0 erreicht, zentrifugieren Sie die MSM-Kulturen 10 Minuten lang bei 3.200 × g und RT (Tischzentrifuge). Entsorgen Sie die Überstände mit sterilen 1-ml-Pipettenspitzen.
         HINWEIS: Der obige Schritt bleibt für Mtb-Kulturen gleich, mit der Ausnahme, dass die Anzahl der Tage 4-7 beträgt. Achten Sie darauf, das Bakterienpellet nicht mit der Pipettenspitze zu berühren.
      2. Waschen: Zu jedem Msm-Pellet 1 ml vorgewärmtes Sauton-Medium (bei RT) geben (Schritt 1.1.2) und vorsichtig mit 1 ml Pipettenspitzen resuspendieren, um eine gleichmäßige Suspension zu erhalten. Verwenden Sie sterile Pipettenspitzen, um die Volumina mit demselben Medium auf 10 ml (in jedem) aufzufüllen. Zentrifugieren Sie die Suspensionen 10 min bei 3.200 × g und RT und verwerfen Sie die Überstände. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.
         HINWEIS: Der obige Schritt bleibt für MTB-Kulturen gleich.
      3. Resuspendieren Sie die zweimal gewaschenen Msm-Zellen in jeweils 20 ml vorgewärmtem Sauton (vorgewärmt in einem Platten- oder Shaker-Inkubator) und messen Sie die optische Dichte der Zellen bei 600 nm. Das erforderliche Volumen an MSM-Kulturen wird in sterile 1-Liter-Erlenmeyerkolben mit ~330 ml sterilen Sauton-Kolben geimpft, so dass der endgültige OD₆₀₀ ~0,05 beträgt.
         HINWEIS: Resuspensionen müssen immer in einem kleinen Volumen beginnen. Wenn das endgültige Volumen in einem einzigen Schritt direkt in das Pellet gegeben wird, bleiben die Zellen als diffundierte Pellets zurück (ein Indikator für eine schlechte Resuspension). Die einzige Möglichkeit, das Problem zu beheben, besteht darin, die Kulturen herunterzufahren und die erneute Sperrung wie empfohlen zu wiederholen. Der obige Schritt bleibt für MTB-Kulturen gleich.
   3. Tag 2/3
      1. Die 330-ml-Kultur wird im Inkubatorschüttler bei 200 U/min und 37 ^°C inkubiert, bis der Kultur-OD_{600 ~0,3} erreicht. Waschen Sie dann die Zellen einmal (ähnlich wie in Schritt 1.2.2.2, aber mit gleichem Volumen) und resuspendieren Sie dann das Pellet im gleichen Volumen. Verteilen Sie jeweils 50 ml der resuspendierten Kulturen auf sechs sterile 1-Liter-Erlenmeyerkolben, die jeweils 280 ml sterile, vorgewärmte Sautons mit 1/10^{des normalerweise} verwendeten (0,05 %) Tween-80, d. h. 0,005 %, enthalten (siehe auch den Hinweis zu Schritt 2.2.1.3., um zu verstehen, warum 1/10^th). Der endgültige OD₆₀₀ muss ca. 0,05 betragen.
         HINWEIS: Verwenden Sie für MTB-Kulturen anstelle von Erlenmeyerkolben Rollflaschen (mit einem Fassungsvermögen von 1/2/4 l). Stellen Sie das Kulturvolumen pro Flasche so ein, dass die Kultur nicht die Mündung der Flasche erreicht, wenn sie auf dem Rollengerät aufbewahrt wird. Das tatsächliche Volumen in der Rollerflasche hängt vom Fassungsvermögen der Rollerflasche ab.
      2. Jede der 330-ml-Kulturen wird im Inkubatorschüttler bei 200 U/min und 37 ^°C inkubiert, bis OD₆₀₀ 2,0 bis 2,5 (~15-18 h) erreicht.
         HINWEIS: Stellen Sie bei Mtb-Kulturen sicher, dass der endgültige OD₆₀₀ ~1,0-1,2 beträgt (dauert ~5-8 Tage).

2. Anreicherung von MSM mEVs durch Dichtegradientenzentrifugation

1. Tag 4
   1. Zentrifugieren Sie die ~2 l MSM-Kulturen im mittleren exponentiellen Stadium in 6 x 400 ml sterilen Zentrifugenflaschen bei 4 ^°C für 20 Minuten bei ~8.000 × g (Bodenzentrifuge). Sammeln Sie den verbrauchten Medien-/Kulturüberstand in zwei vorgekühlten, autoklavierten 1-l-Erlenmeyerkolben und lagern Sie ein Aliquot des Pellets für alle Analyseverfahren (wie SDS-PAGE und Western Blotting - hier nicht detailliert).
      HINWEIS: Alle nachfolgenden Schritte müssen bei Kälte (~ 4 °C) durchgeführt werden, um die Integrität der mEVs besser zu erhalten. Die mEVs sind bei RT recht stabil, aber die Kühlung ist ein Muss für die Langzeitstabilität (wiederholtes Einfrieren und Auftauen wird nicht empfohlen). Während des axenischen Kulturwachstums lösen sich mEVs von der Oberfläche von Msm/Mtb und reichern sich im Kulturüberstand/verbrauchten Medium an.
   2. Filtern Sie den MSM-Kulturüberstand zuerst durch die 0,45-μm-Entsorgungsfiltereinheit(en) und dann durch die 0,22-μm-Entsorgungsfiltereinheit(en), um alle Spuren von Bakterien zu entfernen.
      HINWEIS: Die direkte Filtration durch die 0,22-μm-Filter erstickt häufig die Filtereinheiten (da das Bakterienpellet bei der Durchführung von Schritt 2.1.1 gestört werden kann). Um Mtb-Kulturüberstände zu erzeugen, führen Sie drei Filtrationen von Mtb-Kulturen durch (d. h. erster Filtrationsschritt mit einer 0,45-μm-Einwegfiltereinheit; zwei aufeinanderfolgende Filtrationsschritte mit 0,22-μm-Einwegfiltereinheiten), bevor die Kulturfiltrate in BSL-2-Einstellungen verschoben werden.
2. Tag 4/5
   1. Verwenden Sie die 30-kDa-Membrankonzentratoren, um das Msm-Kulturfiltrat (~2 l) auf ~ 38 ml zu konzentrieren, indem Sie das Kulturfiltrat bei 4 ^°C, 20 min und bei 3.200 × g zentrifugieren.
      1. Die Konzentratoren zuerst mit sterilem, kaltem ddw (~15 ml) vorwaschen (bei 4 ^°C, 5 min und bei 3.200 × g waschen).
      2. Mit ~15 ml vorgefiltertem, kaltem Sauton waschen (gleiche Bedingungen wie für Wasser (2.2.1.1.)), um alle Spuren von Chemikalien (die bei der Herstellung verwendet werden) zu entfernen.
      3. Da ~130 Zentrikonen (bei nur einmaliger Verwendung) technisch erforderlich sind, um ~2 L Kulturfiltrat zu konzentrieren, verwenden Sie die Zentrikone bei Bedarf mindestens 3-4 Mal wieder. Gehen Sie folgendermaßen vor: Konzentrat 15 ml auf 0,5 bis 1,0 ml (folgen Sie Schritt 2.2.1), überführen Sie das Konzentrat in ein sauberes, autoklaviertes und kaltes 38-ml-Ultrazentrifugenröhrchen und überführen Sie dann das verbleibende unkonzentrierte Kulturfiltrat zur wiederholten Konzentration wieder in die verwendeten Zenzentrikone.
         HINWEIS: Die Verwendung von 24, 30 kDa-Konzentratoren zur Konzentration von 2 l Kulturfiltrat dauert bis zu 6 Stunden. Bei der Konzentration des Kulturfiltrats wird auch der Tween-80 konzentriert und kann den Konzentrator blockieren. Die Verwendung von Tween-80 auf 0,005 % endgültig (statt 0,05 %) in Sautons Medien hilft, diese Blockade zu verhindern. Die reduzierte Konzentration von Tween-80 hat keinen Einfluss auf die gleichmäßige Suspension von Msm während des Wachstums und verursacht keine Verklumpung von Msm-Zellen. Da Mtb-Zellen jedoch bei 0,005 % Tween-80 verklumpen, sollten Sie 0,05 % Tween-80 für Mtb-spezifische Elektrofahrzeuge verwenden.
   2. Das konzentrierte MSM-Kulturfiltrat (~38 ml) wird in ein sauberes, gewaschenes (mit ddw) und vorgekühltes 40-50 ml Polypropylen-Zentrifugenröhrchen überführt und einer zweistufigen Zentrifugation unterzogen, zuerst bei 4.000 × g und dann bei 15.000 × g, beide Schritte bei 4 ^°C für 20 Minuten (um alle Ablagerungen zu entfernen). Verwenden Sie dafür eine Bodenzentrifuge.
3. Tag 5/6
   1. Den Kulturüberstand in ein vorgekühltes 38,5-ml-Polypropylen-Ultrazentrifugenröhrchen überführen und in einer Ultrazentrifuge bei 100.000 × g 4 h bei 4 ^°C schleudern.
      HINWEIS: Eine Schaufel funktioniert am besten bei dieser Geschwindigkeit. Stellen Sie sicher, dass Sie das Ultrazentrifugenröhrchen bis zum Rand füllen und ein Balance-Ultrazentrifugenröhrchen mit gleichem Gewicht haben. Wenn eines der Röhrchen nach dem Zentrifugieren (was aufgrund von Kondensation geschieht) am Schaufel klebt, entfernen Sie es vorsichtig mit einer Pinzette vom Rotor. Das Abwischen der kondensierten Feuchtigkeit, die sich auf der Außenfläche der Ultrazentrifuge vor der Ultrazentrifugation befindet, verhindert ein Anhaften.
   2. Bewahren Sie den Überstand in einem 50 ml vorgekühlten Röhrchen auf (siehe Hinweis). Drehen Sie das Ultrazentrifugenröhrchen auf ein frisches, fusselfreies, saugfähiges Papier, um Spuren des Überstandes zu entfernen. Resuspendieren Sie das Pellet in 600 μl HEPES-Pufferlösung (50 mM HEPES und 150 mM NaCl, pH 7,4; vor Gebrauch filtrieren).
      HINWEIS: Speichern Sie den Überstand nur als Sicherungsvorlage. Das native mEV-Pellet erscheint als geleeartiger Fleck mit einem Durchmesser von 5-7 mm, stumpf graugelb bis durchscheinend. Wenn kein Pellet sichtbar ist, wiederholen Sie Schritt 2.3.1, indem Sie den gespeicherten Überstand wiederverwenden. Wenn nach der Wiederholung von Schritt 2.3.1 kein Pellet erscheint, verwerfen und mit Schritt 1.2 neu beginnen. Das Pellet braucht Zeit, um wieder zu suspendieren. Es wird empfohlen, den HEPES-Puffer hinzuzufügen und ihn über Nacht bei 4 ^°C stehen zu lassen, um eine einfache Resuspension zu ermöglichen. Resuspendieren Sie vorsichtig, aber mit wiederholtem Pipettieren (verwenden Sie P200-Spitzen für eine bessere Resuspension) bis zu einer gleichmäßigen Resuspension.
4. Tag 6
   1. Das resuspendierte Pellet wird einer "Iodixanol"-basierten Dichtegradientenzentrifugation unterzogen.
      1. Schichten Sie das resuspendierte Pellet auf den Boden des 13 ml sauberen, gewaschenen (mit ddw) und vorgekühlten ultraklaren Polypropylen-Ultrazentrifugenröhrchens und mischen Sie es vorsichtig (verwenden Sie 1 ml Pipette) mit ~4 ml inerter Dichtegradientenlösung "Iodixanol" (im Handel erhältlich als ~60% w/v-Lösung). Nach dem Schichten des resuspendierten Pellets am Boden des Röhrchens (bis zu einem Maximum von 5 ml) wird dann mit je 1 ml (w/v) von 40 %, 30 %, 20 % und 10 % Untervorräten "Iodixanol" in der jeweiligen Reihenfolge überlagert (Untervorräte (mit HEPES-Puffer) aus 60 % Vorräten vorbereiten). Geben Sie dann 4 ml 6%igen Unterstock (hergestellt aus 60 % Stammstoff mit HEPES-Puffer) oben hinzu, um das Röhrchen zu füllen.
         HINWEIS: Bereiten Sie den Farbverlauf kurz vor dem Gebrauch vor. Niemals aufbewahren und verwenden.
      2. Wiegen Sie das Röhrchen vorsichtig (ohne zu schütteln) in einem Glasbecher und füllen Sie es vorsichtig in den Rotor mit schwingender Schaufel.
         HINWEIS: Das Wiegen ist notwendig, um mit einem Dummy-Rohr (ebenfalls gewogen) auszugleichen.
      3. Es wird 16 h lang bei 141.000 × g bei 4 ^°C ultrazentrifugiert.
5. Tag 7
   1. Das Röhrchen vorsichtig entfernen (siehe Hinweis zu Schritt 2.3.1) und 1 ml Fraktionen in frisch autoklavierte Mikrozentrifugenröhrchen sammeln; Achten Sie auf^{die Brüche 4 bis 6}, die typischerweise die MSM mEVs enthalten.
      HINWEIS: Die mEVs aus diesen Fraktionen werden normalerweise in drei oder vier mEVs-Bänder (eines ist das Hauptband) fraktioniert, die eine mattweiße Farbe haben. Die R-mEVs, die mCherry enthalten, fraktionieren in der 5. bis 7^{. Fraktion und} erscheinen dunkelviolett bis magenta^. Die Mtb-EVs fraktionieren in der Regel in der 5^{. bis 7. Fraktion.} Die Trennung der mEVs im Gradienten hängt von der verwendeten Gradientenkonzentration ab und davon, wie gut der Gradient geschichtet ist. Wenn mEVs teilweise reißen, können sie in früheren Fraktionen zerbrechen. Wenn das nach Schritt 2.3.2 erhaltene Pellet nicht gut resuspendiert wird, bilden die Vesikel alternativ dichte Mikropellets, die als spätere Fraktionen zerfallen. Wir empfehlen eine genaue Erfassung der Fraktionen nur dann, wenn der Benutzer auswerten möchte, welche der 1-ml-Fraktionen die mEVs enthalten. Benutzer können je nach Bequemlichkeit in kleinere oder größere Brüche aliquotieren. Wenn wir sie für bestimmte Anwendungen verwenden, z. B. um sie als potenzielle Auffrischungsimpfung für BCG zu testen, beschränken wir unsere Sammlung der mEVs auf weniger als 250 μl der Fraktionen (wobei mEVs fraktioniert werden), so dass wir spezifisch nur die mEVs-Banden sammeln und wie in 2.7.5 beschrieben verarbeiten können. Dies trägt dazu bei, alle Spuren von Iodixanol, die unsere nachgeschalteten Experimente stören könnten, effektiver zu entfernen.
6. Tag 8
   1. Die mEVs-haltigen Fraktionen werden zusammengefasst, mit HEPES-Puffer auf 38 ml verdünnt und die Ultrazentrifugation bei 4 ^°C für 16 h bei 100.000 × g wiederholt. Resuspendieren Sie das Pellet (wie in Schritt 2.3.2 mit den gleichen Vorsichtsmaßnahmen) entweder in HEPES-Puffer oder in einem anderen Puffer, der für nachgeschaltete Experimente (hier nicht beschrieben) erforderlich ist, wie z. B. Proteinschätzung, Nano-Tracking-Analysen, Negativfärbung, Transmissionselektronenmikroskopie, Western Blot und Immungold-Markierung.
      HINWEIS: Für eine bessere Resuspension beschallen Sie das mEV-haltige Röhrchen 10 Minuten lang mit einem Ultraschall-Wasserbad-Ultraschallgerät. Eine längere Beschallung kann zum Reißen und Verlust intakter mEVs führen. Wenn sie gut aufgehängt wird, ist eine Beschallung unnötig. Alle Schritte von 2.1 bis 2.6 sind identisch, während MTB-generierte Elektrofahrzeuge angereichert werden.

3. Aufbau und Anreicherung von rekombinanten mEVs.

HINWEIS: Eines der 10 am häufigsten vorkommenden Proteine (identifiziert durch Massenspektrometrie) von MSM-EVs ist Cfp-29³⁰. Aufgrund seiner geringen Größe (29 kDa), seiner einfachen Sekundärstruktur 40, seiner Lokalisation an der Membran⁴¹ und seiner Neigung, in axenische Kulturen in verbrauchte Medien sezerniert zu werden (z. B. als Kulturfiltratprotein; das sowohl von Msm als auch von Mtb^42,43 sezerniert wird), wurde es hier ausgenutzt^, um einen rot fluoreszierenden Reporter und ein Protein von Interesse (EsxA_Mtb) in mEVs zu liefern. Um dies zu erreichen,

1. Verwenden Sie geeignete Vorwärts- und Rückwärtsprimer (Tabelle 1; kompatibel für die direkte Klonierung in einen Shuttle-Vektor wie pMV261) für die Amplifikation von cfp-29 aus Msm. Unter Verwendung von ~50 ng hochmolekularer (~>20 kb) genomischer MSM-DNA als Vorlage wird das cfp-29-Genfragment mit einer High-Fidelity-DNA-Polymerase (z. B. Phusion oder Q5) PCR-amplifiziert . Befolgen Sie die Empfehlungen des Herstellers für die PCR.
   ANMERKUNG: Entwerfen Sie die erforderlichen Restriktionsstellen in Primer, um das Klonen in jeden alternativen Shuttle-Vektor von Interesse zu erleichtern. Die PCR-Bedingungen und das PCR-Volumen variieren je nach Art und Marke der verwendeten DNA-Polymerase. Das Volumen der Reaktionsmischung variiert in Abhängigkeit von der Menge der DNA-Matrize und der Menge der DNA-Polymerase. Befolgen Sie die Empfehlungen des Herstellers für PCR-Bedingungen, den Erfolg der Amplifikation und die Eliminierung des unspezifischen Annealings von Primern.
2. PCR Reinigen Sie das eluierte Amplikon mit einem handelsüblichen PCR-Aufreinigungskit und überprüfen Sie die Amplikonlänge durch Standard-Agarose-Gelelektrophorese. Das gereinigte Amplikon verdauen.
   1. Schätzen Sie die Menge des gereinigten Amplikons auf einem Spektralphotometer. Verwenden Sie mindestens 2 μg cfp-29-Amplikon für die Verdauung.
   2. Zuerst mit BstB1 bei 65 °C für 1 h verdauen (Art und Menge des Puffers und Enzyms - gemäß den Empfehlungen des Herstellers), die Reaktionstemperatur auf RT senken und dann mit HindIII für 1 h bei 37 ^°C verdauen (Art und Menge des Puffers und Enzyms - gemäß den Empfehlungen des Herstellers).
   3. PCR reinigt und eluiert das verdaute Amplikon in 50 μl autoklaviertem nukleasefreiem ddw.
   4. Schätzen Sie die Konzentration und Ausbeute des aufgeschlossenen Amplikons mit einem Spektralphotometer. Bei -20 ^°C lagern, bis die Ligatur eingerichtet ist. HINWEIS: Überprüfen Sie nach der PCR die Amplikonlänge (~798 + 50 bp) und die Ausbeute, indem Sie 10 μl der PCR-Reaktionsmischung auf einem 1%igen Agarose-Gel elektrophoresieren. Obwohl ein doppelter Verdau mit dieser Kombination von Enzymen nicht möglich ist, verhindert ein kompatibler Puffer eine wiederholte PCR-Aufreinigung und den anschließenden Verlust des verdauten Amplikons. Die Konzentration des verdauten Amplikons variiert je nach Kit, das für die PCR-Aufreinigung verwendet wird. Sie variiert auch mit der Länge (in bp) alternativer Vektoren der Wahl.
3. Verwenden Sie die Vorwärts- und Rückwärtsprimer (Tabelle 1), eine DNA-Polymerase und ~50 ng genomische Mtb-DNA, PCR amplifizieren esxA- oder esxA-3X FLAG-Tag-spezifisches Amplicon. Verwenden Sie ~5 ng geeigneter Plasmid-DNA zur PCR-Amplifikation von mCherry. Plasmid- und Sequenzdetails befinden sich in der Zusatzdatei 1.
   HINWEIS: Verwenden Sie einen Glycin-, Glycin-, Glycin-,^{Glycin-44,45(G4S})-Linker zwischen cfp-29 und mCherry/esxA/esxA-3X FLAG; Vor dem Start von mCherry hilft der G4S-Linker mCherry, keine unechten nicht-funktionalen Falten zu durchlaufen (einschließlich solcher, die von Cfp-29 angetrieben werden). Siehe cfp-29-, hsp60-Promotor-, mCherry- und esxA-Sequenzen in Ergänzungsdatei 1. Plasmide, die als Templates für mCherry dienen, sind in verschiedenen Plasmid-Repositorien/-Banken verfügbar. Es stehen verschiedene Versionen (leicht veränderte Sequenzen) von mCherry zur Verfügung, die veränderte Vorwärts- und Rückwärts-Primersequenzen erfordern. Die Primer (Tabelle 1) helfen bei der Amplifikation der in Ergänzungsdatei 1 erwähnten mCherry. Die Fusion des N-Terminus von mCherry/esxA/esxA::3XFLAG mit dem C-terminalen Ende von Cfp-29 funktioniert gut.
4. Verdauen Sie 1 μg DNA der mCherry/esxA/esxA::3XFLAG-Amplikons und reinigen Sie die verdaute DNA.
   1. Jedes Amplikon mit HindIII und HpaI 1 h lang bei 37 ^°C (oder gemäß den Empfehlungen des Herstellers) doppelt verdauen.
   2. Verwenden Sie ein handelsübliches PCR-Aufreinigungskit und die Empfehlungen des Herstellers für die Reinigung des verdauten Amplikons. Das verdaute Amplikon wird in 50 μl autoklaviertem nukleasefreiem ddw eluiert.
   3. Schätzen Sie die Konzentration und Ausbeute des aufgeschlossenen Amplikons mit einem Spektralphotometer. Bei -20 ^°C lagern, bis die Ligatur eingerichtet ist.
5. Verdauen Sie 2 μg pMV261-Kan^R (Ergänzungsdatei 1) oder einen geeigneten Klonierungsvektor mit dem/den Enzym(en) Ihrer Wahl.
   1. Zuerst mit BstB1 bei 65 °C für 1 h verdauen (Art und Menge des Puffers und Enzyms - gemäß den Empfehlungen des Herstellers), die Reaktionstemperatur auf RT senken und dann mit HindIII für 1 h bei 37 ^°C verdauen (Art und Menge des Puffers und Enzyms - gemäß den Empfehlungen des Herstellers).
   2. Gel reinigen und eluieren in 50 μl autoklaviertem nukleasefreiem ddw.
   3. Schätzen Sie die Konzentration und Ausbeute des verdauten Vektors mit einem Spektralphotometer. Bei -20 ^°C lagern, bis die Ligatur eingerichtet ist.
      HINWEIS: Die Klonierung von zwei Fragmenten in einem Schritt ist mit den oben genannten Primern für pMV261 möglich. Jeder alternative Shuttle-Vektor, der als Episom überlebt, funktioniert. Integrative Plasmide funktionieren ebenfalls, aber die rekombinante Proteinausbeute wird pro Zellbasis relativ gering sein.
6. Ligatieren und in einen kompatiblen Stamm von E. coli umwandeln.
   1. Für die Ligatur werden 125 ng des Vektors verwendet. Verwenden Sie entsprechend verdaute mCherry/esxA/esxA::3XFLAG-Amplikons in einem molaren Verhältnis von 1:3. Die Ligatur über Nacht mit T4 DNA Ligase (Menge gemäß Herstellerempfehlung) bei 16 °C im gekühlten Umlaufwasserbad durchführen.
      HINWEIS: Verwenden Sie geeignete Kontrollen, wie z. B. Vektoren nur mit und ohne T4-DNA-Ligase, um die Effizienz der Verdauung zu bewerten und die Effizienz des Klonerfolgs vorherzusagen.
   2. Transformation
      1. NEB5α chemisch kompetente Zellen aliquots (~100 μl pro Transformation) 15 Minuten lang auf Eis auftauen. Zweimal vorsichtig mit einer sterilen Pipettenspitze mischen. Geben Sie eine Ligationsmischung (bis zu 20 μl) zu den kältekompetenten Zellen.
      2. Mischen Sie vorsichtig Pipettenzellen + ligierte DNA. Die Mischung weitere 30 Minuten auf Eis inkubieren.
      3. Hitzeschock bei 42 °C (im zirkulierenden Wasserbad) für 60 s geben und sofort für weitere 15 Minuten wieder auf Eis überführen.
      4. Die transformierten Zellen werden durch Zugabe von 1 ml SOC-Bouillon (2 % Trypton, 0,5 % Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM_MgSO4 und 20 mM Glukose) gewonnen und bei 37 °C für 1 h bei 200 U/min inkubiert.
      5. Die zurückgewonnenen Bakterien werden in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen (3000 × g, RT und 10 min) heruntergeschleudert, der Überstand verworfen, das Pellet in 200 μl sterilem, vorgewärmtem, frisch zubereitetem LB-Medium resuspendiert und die Suspension auf frisch gegossenen LB Miller-Agarplatten verteilt, die die erforderlichen Antibiotika in angemessener Konzentration enthalten.
      6. Inkubieren Sie die Petrischalen in einem Platteninkubator, der auf 37 ^°C voreingestellt ist.
7. Screening (hier nicht detailliert) auf potentielle Klone, Verifizierung (mittels Kolonie-PCR-/Restriktionsenzymen)⁴⁶ und Sequenzierung (Sanger-Sequenzierung), um die Fusion zu bestätigen.
8. Extrahieren Sie Plasmid-DNA (~200 ng/1-2 μL; jedes kommerziell erhältliche Kit) des bestätigten Klons (E. coli-Hintergrund ) und transformieren Sie sie in frisch hergestellte elektrokompetente Zellen von Msm.
9. Präparation von elektrokompetenten Msm-Zellen
   1. Frisch wachsendes Msm (wie in den Schritten 1.2.1 und 1.2.2). Waschen Sie das frisch gewachsene Msm wie in den Schritten 1.3.3 und 1.3.4 (außer verwenden Sie 7H9 + ADC + Tween-80 (reichhaltig) anstelle von Sauton).
   2. Man fügt ein Aliquot der gewaschenen Msm-Zellen zu einem endgültigen OD 600 von ~0,05 in einem sterilen 500-ml-Erlenmeyerkolben hinzu, der₁₅₀ ml reichhaltiges Medium enthält.
   3. Im Inkubatorschüttler bei 200 U/min und 37 ^°C inkubieren, bis der Kultur-OD_{600 ~0,8} bis 1,0 (~12-14 h) erreicht.
   4. Die Kultur in eine vorgekühlte 400-ml-Zentrifugenflasche überführen und 60-90 Minuten auf Eis inkubieren. Dann werden die Zellen bei 4 ^°C für 15 Minuten bei 4.000 × g pelletiert.
   5. Waschen Sie die Zellen zweimal (jeweils mit 150 ml, bei 4.000 × g, 4 ^°C und 15 min) mit eiskaltem, sterilem (autoklaviertem) 10%igem Glycerin.
      HINWEIS: Mit jeder Wäsche löst sich das Pellet. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie den gesamten Überstand (nach jeder Wäsche) entsorgen. Andernfalls geht der Großteil der Zellen im ausrangierten Überstand verloren.
   6. Waschen Sie die Zellen noch einmal mit 75 ml eiskaltem, sterilem 10%igem Glycerin, das 0,005% Tween-80 enthält.
   7. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 7,5 ml 10 % Glycerin mit 0,005 % Tween-80 und aliquot in 400 μl Aliquoten.
      HINWEIS: Obwohl elektrokompetente MSM-Zellen mindestens 4 Monate lang kompetent sind, liefern frisch zubereitete elektrokompetente Zellen die besten Ergebnisse. Bei der Verwendung alter kompetenter Zellen erscheinen einige nicht-rosafarbene Kolonien (weiße) als falsche Transformanten. Je älter die kompetenten Zellen, desto mehr weiße Kolonien.
10. Transformation von MSM
    1. Tauen Sie die MSM-kompetenten Zellen aliquot auf Eis auf.
       HINWEIS: Das Auftauen bei RT und das Umwandeln solcher Zellen führt zu einer geringeren Effizienz.
    2. Geben Sie 1-2 μl Plasmid-DNA (~200 ng insgesamt) zu den kalten kompetenten Zellen, mischen Sie vorsichtig mit einer sterilen 1-ml-Pipettenspitze und geben Sie sie in eine vorgekühlte sterile 2-mm-Elektroporationsküvette.
    3. Übertragen Sie die geschlossene Küvette mit einer Mischung aus MSM-kompetenten Zellen + Plasmid-DNA in die Maus des Elktroporators, schließen Sie den Deckel vorsichtig und legen Sie einen Impuls (exponentieller Zerfallstyp) bei 2,5 kV (Spannung), 25 μF (Kapazität) und 1000 Ω (Widerstand) an.
    4. Sofort 1 ml vorgewärmtes sterilreiches Medium (7H9 + ADC + Tween-80) in die Küvette geben, vorsichtig mit einer sterilen 1-ml-Pipettenspitze mischen und den gesamten Inhalt in ein steriles 10-ml-Röhrchen überführen.
    5. Inkubieren Sie den Inhalt 3 Stunden lang in einem Inkubatorschüttler, der auf 37 ^°C und 200 U/min eingestellt ist. Schleudern Sie den Inhalt in einem Mikrozentrifugenröhrchen (4.000 × g, RT und 10 min), verwerfen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Pellet in 200 μl sterilem, vorgewärmtem reichhaltigem Medium und verteilen Sie die Suspension auf frisch gegossenen 7H11-Agarplatten, die ADC, Tween-80 und die erforderlichen Antibiotika in geeigneten Konzentrationen enthalten.
       HINWEIS: Verwenden Sie bei Bedarf Hygromycin, Kanamycin und Apramycin in den Endkonzentrationen von 50 μg/ml, 25 μg/ml bzw. 50 μg/ml. MSM an sich ist NICHT resistent gegen diese Antibiotika. Verwenden Sie diese Antibiotika nur, wenn Sie Plasmide mit den entsprechenden resistenten Genen für die Selektion/das Wachstum von Transformanten/rekombinanten MSM-Kolonien verwenden.
    6. Inkubieren Sie die Petrischalen in einem Platteninkubator, der auf 37 ^°C eingestellt ist. Typischerweise treten Transformanten zwischen 3 und 5 Tagen auf.
       HINWEIS: Wenn ein Protein von Interesse toxisch für MSM ist, können die Transformanten später auftreten oder nicht entstehen. Klonen Sie in solchen Fällen abgeschnittene Versionen der vollen Länge.
    7. Legen Sie Glycerinvorräte der entstehenden MSM-Kolonien an, nachdem Sie sie auf positive Klone überprüft haben (wie Schritt 3.7)
11. Um R-mEVs anzureichern, die entweder mCherry- oder EsxA-Proteine enthalten, züchten Sie zunächst R-Msm, das entweder mCherry oder exsA oder esxA::3X FLAG exprimiert, indem Sie die Schritte 1.2.1 bis 1.2.3 und dann die Schritte 2.1 bis 2.6 ausführen. zur Anreicherung von R-mEVs. Die R-mEVs eluieren in den Spin des 4.-7.^Bruchs nach dem Dichtegradienten (Schritt^2.5). Die R-mEVs pelletieren nach dem ersten Ultrazentrifugationsschritt (2.3.1). Vergewissern Sie sich nach der Ausführung wie in Schritt 2.3.1, dass die R-mEVs als dunkelviolettes bis magentafarbenes Pellet mit einem Durchmesser von 5-7 mm unten in der Mitte der Ultrazentrifuge sichtbar sind.
12. Führen Sie westliche Analysen⁴⁷ (hier nicht detailliert) durch, um Proteine von Interesse in den angereicherten R-mEVs nachzuweisen.

Ergebnisse

Wir verwenden M. smegmatis (Msm) als Modellmykobakterium, um die Anreicherung sowohl von nativen als auch von rekombinanten mEVs (R-mEVs) zu demonstrieren. Dieses schematisch zusammengefasste mEVs-Anreicherungsprotokoll (Abbildung 1) funktioniert auch für die Anreicherung von R-mEVs von MSM und nativen EVs von Mtb (mit geringfügigen Modifikationen wie in den Protokollanmerkungen von 1.2). Die Visualisierung der angereicherten mEVs erfordert eine negative Färbung unter einem Trans...

Diskussion

Da die Entwicklung eines neuartigen TB-Impfstoffs, der BCG überlegen ist und ihn ersetzen kann, nach wie vor eine große Herausforderung darstellt, verfolgen mehrere Gruppen die Entdeckung verschiedener TB-Impfstoffe mit Untereinheiten, die die Wirksamkeit von BCG steigern und seine Schutzdauer verlängern können^48,49. Angesichts der zunehmenden Aufmerksamkeit für bakterielle EVs (bEVs) als potentielle Untereinheiten und als natürliche Adjuvantien

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
A2 type Biosafety Cabinet	Thermo Fisher Scientific, USA		1300 series
Bench top Centrifuge	Eppendorf, USA		5810 R
BstB1, HindIII, HpaI	NEB, USA		NEB
Cell densitometer	GE Healthcare, USA		Ultraspec 10
Citric Acid	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Dibasic Potassium Phosphate	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Double Distilled Water	Merck, USA		~18.2 MW/cm @ 25 oC
Electroporation cuvettes	Bio-Rad, USA		2 mm
Electroporator	Bio-Rad, USA		Electroporator
EsxA-specific Ab	Abcam, UK		Rabbit polyclonal
Ferric Ammonium Citrate	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Floor model centrifuge	Thermo Fisher Scientific, USA		Sorvall RC6 plus
Glassware	Borosil, INDIA		1 L Erlenmeyer flasks
Glycerol	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
HEPES and Sodium Chloride	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Incubator shakers	Thermo Fisher Scientific, USA		MaxQ 6000 & 8000
L-Asparagine	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Luria Bertani Broth and Agar, Miller	Hi Media, INDIA		Hi Media
Magnesium Sulfate Heptahydrate	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Magnetic stirrer	Tarsons, INDIA		Tarsons
mCherry-specific Ab	Abcam, UK		Rabbit monoclonal
Microwave	LG, INDIA		MC3286BLT
Middlebrook 7H9 Broth	BD, USA		Difco Middlebrook 7H9 Broth
Middlebrook ADC enrichment	BD, USA		BBL Middlebrook ADC enrichment
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific, USA		Spectronic 200 UV-Vis
NEB5a	NEB, USA		a derivative of DH5a
Optiprep (Iodixanol)	Merck, USA		Available as 60% stock solution (in water)
PCR purification kit	Hi Media, INDIA		Hi Media
pH Meter	Mettler Toledo, USA		Mettler Toledo
Plasmid DNA mini kit	Hi Media, INDIA		Hi Media
Plate incubator	Thermo Fisher Scientific, USA		New Series
Plasmid pMV261	Addgene, USA * *The   plasmid   is   no   more available in this plasmid bank		Shuttle vector
Proof-reading DNA Polymerase	Thermo Fisher Scientific, USA		Phusion DNA Plus Polymerase
Q5 Proof-reading DNA Polymerase	NEB, USA		NEB
Refrigerated circulating water bath	Thermo Fisher Scientific, USA		R20
Middlebrock 7H11 Agar base	BD, USA		BBL Seven H11 Agar base
SOC broth	Hi Media, INDIA		Hi Media
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
T4 DNA Ligase	NEB, USA		NEB
Tween-80	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Ultracentrifuge	Beckman Coulter, USA		Optima L100K
Ultracentrifuge tubes - 14 mL	Beckman Coulter, USA		Polyallomer type – ultra clear type in SW40Ti rotor
Ultracentrifuge tubes - 38 mL	Beckman Coulter, USA		Polypropylene type– cloudy type for SW28 rotor
Ultrasonics cleaning waterbath sonicator	Thermo Fisher Scientific, USA		Sonicator - bench top model
0.22 µm Disposable filters	Thermo Fisher Scientific, USA		Nunc-Nalgene
30-kDa Centricon concentrators	Merck, USA		Amicon Ultra centrifugal filters - Millipore
3X FLAG antibody	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
400 mL Centrifuge bottles	Thermo Fisher Scientific, USA		Nunc-Nalgene
50 mL Centrifuge tubes	Corning, USA		Sterile, pre-packed
Bacteria
Strain
Escherichia coli	NEB, USA		NEB 5-alpha (a derivative of DH5α).
Msm expressing cfp29::mCherry	This study		MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA	This study		MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG	This study		MC2 155
Mycobacterium smegmatis (Msm)	Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA		MC2 155