Charakterisierung von Zinktransportern in Säugetieren mit einem In-vitro-Zinktransportassay

Zusammenfassung

Die Messung des Zinktransports hat sich aufgrund der schwachen kausalen Verbindungen zur Proteinfunktion und der geringen zeitlichen Auflösung als schwierig erwiesen. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Überwachung der Zn2+-Extrusion aus lebenden Zellen mit hoher zeitlicher Auflösung unter Verwendung eines Zn2⁺-empfindlichen Fluoreszenzfarbstoffs, der eine direkte Messung des^Zn2+-Ausflusses ermöglicht.

Zusammenfassung

Übergangsmetalle wie^Zn2+-Ionen müssen aufgrund ihrer zellulären Toxizität streng reguliert werden. Bisher wurde die Aktivität von Zn2⁺-Transportern indirekt gemessen, indem das Expressionsniveau des Transporters unter verschiedenen Konzentrationen von^Zn2+ bestimmt wurde. Dies geschah mit Hilfe der Immunhistochemie, der Messung von mRNA im Gewebe oder der Bestimmung des zellulären^Zn2+-Spiegels. Mit der Entwicklung intrazellulärer^Zn2+-Sensoren werden die Aktivitäten von Zinktransportern derzeit hauptsächlich durch die Korrelation von Veränderungen des intrazellulären Zn 2+, die mit fluoreszierenden Sonden nachgewiesen werden, mit der Expression der Zn²⁺-Transporter bestimmt. Doch auch heute noch beobachten nur wenige Labore die dynamischen Veränderungen des intrazellulären^Zn2+ und messen damit direkt die Aktivität von Zinktransportern. Ein Teil des Problems besteht darin, dass von den 10 Zinktransportern der ZnT-Familie, mit Ausnahme von ZnT10 (transportiert Mangan), nur Zinktransporter 1 (ZnT1) an der Plasmamembran lokalisiert ist. Daher ist es schwierig, die Transportaktivität mit Änderungen der intrazellulären^Zn2+-Konzentration in Verbindung zu bringen. Dieser Artikel beschreibt einen direkten Weg zur Bestimmung der Zinktransportkinetik mit einem Assay, der auf einem zinkspezifischen Fluoreszenzfarbstoff, FluoZin-3, basiert. Dieser Farbstoff wird in seiner Esterform in Säugetierzellen geladen und dann aufgrund der zellulären Diesteraseaktivität im Zytosol gefangen. Die Zellen werden mit Zn2+ beladen, indem das^Zn2+-Ionophor Pyrithion verwendet wird. Die ZnT1-Aktivität wird aus dem linearen Teil der Fluoreszenzreduktion nach der Zellauswaschung beurteilt. Die gemessene Fluoreszenz bei einer Anregung von 470 nm und einer Emission von 520 nm ist proportional zum freien intrazellulären Zn²⁺. Die Auswahl der Zellen, die ZnT1 exprimieren, die mit dem mCherry-Fluorophor markiert sind, ermöglicht es, nur die Zellen zu überwachen, die den Transporter exprimieren. Dieser Assay wird verwendet, um den Beitrag verschiedener Domänen des ZnT1-Proteins zum Transportmechanismus von humanem ZnT1 zu untersuchen, einem eukaryotischen Transmembranprotein, das überschüssiges Zink aus der Zelle extrudiert.

Einleitung

Zink ist ein essentielles Spurenelement im zellulären Milieu. Es enthält ein Drittel aller Proteine und ist an verschiedenen zellulären Prozessen beteiligt, wie z. B. Katalyse¹, Transkription² und Strukturmotive³. Obwohl sie redoxinert sind, sind hohe Zinkkonzentrationen für die Zelle toxisch, weshalb kein Säugetierorganismus ohne das Vorhandensein von Mechanismen zur Regulierung der Zinkhomöostase überlebt hat. Bei Säugetieren sind drei Mechanismen für diesen Prozess verantwortlich: (1) Metallothionine, das sind zytosolische Cystein-reiche Proteine, die Zink mit hoher Affinität binden und so eine....

Protokoll

1. Zelltransfektion

1. Kultur HEK293T Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS), 2 mM L-Glutamin und 1x Penicillin/Streptomycin (siehe Materialtabelle) in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C/5 % CO₂ bis zum Zusammenfluss auf einer 10 cm großen Platte (8,8 x 10⁶ Gesamtzellen).
2. Legen Sie ein 13-mm-Deckglas in jede der Vertiefungen einer 12-Well-Platte. Verdünnen Sie 0,44 x 10⁶ trypsinisierte Zellen aus Schritt 1.1 in 12 ml vollständigem DMEM. Mischen Sie gut, indem Sie drei- bis fünfmal auf und ab pipettieren. Füllen Sie jede Ver....

Diskussion

Die oben beschriebene Methode ermöglicht die direkte Messung der intrazellulären Zinkkonzentration mit hoher zeitlicher Auflösung. Im Vergleich zu anderen Methoden kann diese Methode, bei der Veränderungen des intrazellulären^Zn2+ überwacht werden, das Hintergrundrauschen erheblich verringern. Darüber hinaus eliminiert die Selektivität des Farbstoffs für Zink mögliche Kreuzwechselwirkungen mit anderen Metallkationen^18,19. Schließlich ermögli.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm plate	greiner bio-one	664160
12-well cell culture plate	greiner bio-one	665180
13 mm coverslips	Superior Marienfeld	111530
22 mm cover slides	Superior Marienfeld	101050
6-well culture plate	greiner bio-one	657160
Bovine serum albumin	bioWorld	22070008
Calcium chloride anhydrous, granular	Sigma Aldrich	C1016	Concentration in Ringer solution: 1 mM
D-(+)-Glucose	Glentham Life Science	GC6947	Concentration in Ringer solution: 10 mM
Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM)	Sartorius	01-055-1A
Eclipse Ti inverted microscope	Nikon	TI-DH	Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cytiva	SH30088.03
Fine tweezers	Dumont	0203-55-PS
Fluozin-3AM	Invitrogen	F24195
HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution	Cytiva	SV30010
LED illumination system	CoolLED	pE-4000
L-glutamine	Biological Industries	03-020-1B
Magnesium chloride hexahydrate	Merck	1.05833	Concentration in Ringer solution: 0.8 mM
N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES)	Formedium	HEPES10	Concentration in Ringer solution: 10 mM
Neo 5.5 sCMOS camera	ANDOR	DC-152Q-FI
NIS-Elements imaging software	Nikon	AR
Pluronic acid F-127	Millipore	540025
Pottasium chloride	Bio-Lab	163823	Concentration in Ringer solution: 5.4 mM
Pyrithione	Sigma Aldrich	H3261	Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM
Silicone Grease Kit	Warner Instruments	W4 64-0378
Sodium chloride	Bio-Lab	190305	Concentration in Ringer solution: 120 mM
Zinc sulfate			Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM
	Sigma Aldrich	31665