Linksatriale Ligatur im aviären Embryo als Modell für veränderte hämodynamische Belastung während der frühen Gefäßentwicklung

Zusammenfassung

In dieser Arbeit stellen wir ein detailliertes visuelles Protokoll für die Durchführung des Modells der linksatrialen Ligatur (LAL) im Vogelembryo vor. Das LAL-Modell verändert den intrakardialen Fluss, was die Belastung durch Wandscherspannung verändert und das hypoplastische Linksherzsyndrom nachahmt. Es wird ein Ansatz vorgestellt, um die Herausforderungen dieses schwierigen mikrochirurgischen Modells zu bewältigen.

Zusammenfassung

Aufgrund seiner vierkammerigen reifen ventrikulären Konfiguration, der einfachen Kultur, des Zugangs zur Bildgebung und der Effizienz ist der Vogelembryo ein bevorzugtes Wirbeltiermodell für die Untersuchung der kardiovaskulären Entwicklung. Studien, die darauf abzielen, die normale Entwicklung und die Prognose von angeborenen Herzfehlern zu verstehen, übernehmen dieses Modell in großem Umfang. Mikroskopische Operationstechniken werden eingeführt, um die normalen mechanischen Belastungsmuster zu einem bestimmten embryonalen Zeitpunkt zu verändern und die nachgeschaltete molekulare und genetische Kaskade zu verfolgen. Die häufigsten mechanischen Eingriffe sind die Ligatur der linken Vitellinvene, das konotrunkale Band und die linksatriale Ligatur (LAL), die den intramuralen Gefäßdruck und die Wandscherbelastung aufgrund des Blutflusses moduliert. Die LAL ist, insbesondere wenn sie in ovo durchgeführt wird, der anspruchsvollste Eingriff, mit sehr geringen Probenausbeuten aufgrund der extrem feinen sequentiellen mikrochirurgischen Eingriffe. Trotz seines hohen Risikos ist LAL in ovo wissenschaftlich sehr wertvoll, da es die Pathogenese des hypoplastischen Linksherzsyndroms (HLHS) nachahmt. HLHS ist ein klinisch relevanter, komplexer angeborener Herzfehler, der bei menschlichen Neugeborenen beobachtet wird. Ein detailliertes Protokoll für in ovo LAL ist in diesem Artikel dokumentiert. Kurz gesagt, befruchtete Vogelembryonen wurden bei 37,5 °C und 60 % konstanter Luftfeuchtigkeit inkubiert, typischerweise bis sie die Hamburger-Hamilton (HH)-Stadien 20 bis 21 erreichten. Die Eierschalen wurden aufgebrochen und die äußere und innere Membran entfernt. Der Embryo wurde vorsichtig gedreht, um den linken Vorhofkolben des gemeinsamen Vorhofs freizulegen. Vormontierte Mikroknoten aus 10-0 Nylonnähten wurden vorsichtig positioniert und um die linke Vorhofknospe gebunden. Schließlich wurde der Embryo in seine ursprüngliche Position zurückgebracht und die LAL war abgeschlossen. Normale und LAL-instrumentierte Ventrikel zeigten statistisch signifikante Unterschiede in der Gewebeverdichtung. Eine effiziente Pipeline zur Generierung von LAL-Modellen würde zu Studien beitragen, die sich auf synchronisierte mechanische und genetische Manipulation während der embryonalen Entwicklung kardiovaskulärer Komponenten konzentrieren. Ebenso wird dieses Modell eine gestörte Zellquelle für die Gewebekulturforschung und die Gefäßbiologie darstellen.

Einleitung

Angeborene Herzfehler (KHK) sind strukturelle Störungen, die aufgrund einer abnormen Embryonalentwicklung auftreten¹. Neben genetischen Gegebenheiten wird die Pathogenese durch veränderte mechanische Belastung beeinflusst ^2,3. Das hypoplastische Linksherzsyndrom (HLHS), ein angeborener Herzfehler, führt zu einer unterentwickelten Herzkammer/Aorta bei der Geburt⁴ mit einer hohen Mortalitätsrate ^5,6. Trotz der jüngsten Fortschritte in der klinischen Behandlung sind das Gefäßwachstum und die Entwicklungsdyna....

Protokoll

Fruchtbare weiße Leghorn-Eier werden von vertrauenswürdigen Lieferanten bezogen und nach von der Universität genehmigten Richtlinien bebrütet. Kükenembryonen in den Stadien 18 (Tag 3) bis 24 (Tag 4) (die in diesem Artikel vorgestellten Stadien) gelten gemäß der Richtlinie 2010/63/EU der Europäischen Union (EU) und den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) in den USA nicht als lebende Wirbeltiere. Kükenembryonen gelten nach US-Recht nach dem 19. Tag der Inkubation als "lebende Tiere", jedoch nicht für die EU. Jedes Ei ist mit dem Startdatum des Schlüpfens gekennzeichnet und soll spätestens am 10. Tag der Inkubation schlüpfen^. Na....

Diskussion

Beim HLHS ist der Blutfluss aufgrund struktureller Defekte verändert, was zu einer abnormen Morphologie auf der linken Seite führt ^4,6. Das vorliegende Modell bietet ein praktisches experimentelles System, um das Fortschreiten des HLHS besser zu verstehen und könnte sogar seine Pathogenese nachahmen⁸. Die Etablierung eines vollständig klinisch äquivalenten HLHS-Tiermodells ist jedoch eine herausfordernde Aufgabe. Zusätzlich zu dem hi.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 nylon surgical suture	Ethicon
Elastica van Gieson staining kit	Sigma-Aldrich	115974	For staining connective tissues in histological sections
Ethanol absolute	Interlab	64-17-5	For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water.
Incubator	KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A	AZYSS600-110
Kimwipes	Interlab	080.65.002
Microscissors	World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL	555640S	Vannas STR 82 mm
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	Sealing stage for egg reincubation
Paraplast Bulk	Leica Biosystems	39602012	Tissue embedding medium
Stereo Microscope	Zeiss Stemi 508	Stemi 508	Used at station 1
Stereo Microscope	Zeiss Stemi 2000-C	Stemi 2000-C	Used at station 2
Tweezer (Dumont 4 INOX #F4)	Adumont & Fils, Switzerland		Used to return the embryo
Tweezer (Super Fine Dumont #5SF)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL	501985	Used to remove the membranes on the embryo