Scherprobenprotokoll zur Bestimmung von Einzelzell-Materialeigenschaften

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Quantifizierung der mechanischen Eigenschaften von krebsartigen und nicht-krebsartigen Zelllinien in vitro. Konservierte Unterschiede in der Mechanik von Krebszellen und normalen Zellen können als Biomarker dienen, der Auswirkungen auf die Prognose und Diagnose haben kann.

Zusammenfassung

Unregelmäßige Biomechanik ist ein Kennzeichen der Krebsbiologie und Gegenstand umfangreicher Untersuchungen. Die mechanischen Eigenschaften einer Zelle ähneln denen eines Materials. Die Stress- und Belastungsresistenz einer Zelle, ihre Relaxationszeit und ihre Elastizität sind Eigenschaften, die sich ableiten und mit anderen Zelltypen vergleichen lassen. Die Quantifizierung der mechanischen Eigenschaften von krebsartigen (bösartigen) im Vergleich zu normalen (nicht-bösartigen) Zellen ermöglicht es den Forschern, die biophysikalischen Grundlagen dieser Krankheit weiter aufzudecken. Während bekannt ist, dass sich die mechanischen Eigenschaften von Krebszellen durchweg von den mechanischen Eigenschaften normaler Zellen unterscheiden, fehlt ein experimentelles Standardverfahren, um diese Eigenschaften aus Zellen in Kultur abzuleiten.

In dieser Arbeit wird ein Verfahren zur Quantifizierung der mechanischen Eigenschaften einzelner Zellen in vitro mit Hilfe eines Fluid-Shear-Assays beschrieben. Das Prinzip hinter diesem Assay besteht darin, eine einzelne Zelle durch Flüssigkeitsscherspannung zu belasten und die daraus resultierende Zellverformung im Laufe der Zeit optisch zu überwachen. Die mechanischen Eigenschaften der Zelle werden anschließend mit Hilfe der digitalen Bildkorrelation (DIC) charakterisiert und ein geeignetes viskoelastisches Modell an die aus der DIC-Analyse generierten experimentellen Daten angepasst. Insgesamt zielt das hier skizzierte Protokoll darauf ab, eine effektivere und gezieltere Methode für die Diagnose schwer behandelbarer Krebserkrankungen bereitzustellen.

Einleitung

Die Untersuchung der biophysikalischen Unterschiede zwischen krebsartigen und nicht-krebsartigen Zellen ermöglicht neue diagnostische und therapeutische Möglichkeiten¹. Das Verständnis, wie Unterschiede in der Biomechanik/Mechanobiologie zum Fortschreiten von Tumoren und zur Therapieresistenz beitragen, wird neue Wege für eine zielgerichtete Therapie und Frühdiagnose aufzeigen².

Während bekannt ist, dass sich die mechanischen Eigenschaften von Krebszellen von denen normaler Zellen unterscheiden (z. B. Viskoelastizität der Plasmamembran und der Kernhülle)

Protokoll

1. Vorbereitung für den Einzelzell-Schertest

1. Zellkultur
   1. Säen Sie ca. 50.000 suspendierte Einzelzellen in einer 35 mm x 10 mm großen Petrischale mit 2 ml Nährmedien.
      Anmerkungen: Wirbeln Sie die suspendierten Zellen vor der Aussaat, um Zellaggregate aufzubrechen.
   2. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und warten Sie zwischen 10 und 48 Stunden für die Zellanhaftung und die vollständige Bildung von Zytoskelettproteinen.
      HINWEIS: Berücksichtigen Sie die Dauer der zellulären Anhaftung sowie die Proliferations- und Wachstumsraten, um ein angemessenes zelluläres Wachstum und eine angemessene Anhaftung zu gewährleisten und gleic....

Diskussion

Die Shear-Assay-Methode, die die Einrichtung einer pseudo-mechanobiologischen Umgebung umfasst, um die Interaktion von Zellen mit der umgebenden mechanischen Mikroumgebung und ihre Reaktionen auf mechanische Belastungen zu simulieren, hat einen Katalog zellulärer mechanischer Eigenschaften hervorgebracht, deren Muster konservierte physikalische Atypien zwischen krebsartigen Zelllinien aufweisen 3,4,5,7,8

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
CELL CULTURE
.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x[-] sodium bicarbonate	Corning	25-053-ci	For cellular detachment from substrate in cell culture
15 mL centrifuge tubes	Falcon by Corning	05-527-90
35 mm Petri dishes	Corning	430165
50 mL centrifuge tubes	Falcon by Corning	14-432-22
centrifuge	any		For sterile cell culture
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) 1x	Corning	10-013-cv	Or any other media for culturing cells. DMEM was used for culturing U87 cells
gloves	any		For sterile cell culture
Heracell Vios 160i CO2 Incubator	Thermo Scientific	51033770	For Incubation during cell culture
Hood	any		For sterile cell culture
micropipette	any		For sterile cell culture
micropipette tips	any		For sterile cell culture
Microscope	Leica/any		For sterile cell culture
Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium PBS, 1x	Corning	21-040-CM
pipetman	any		For sterile cell culture
pipette tips	any		For sterile cell culture
Precision GP 10 liquid incubator	Thermo Scientific	TSGP02
T25 flask	Corning	430639
T75 flask	Corning	430641U
SHEAR ASSAY
100 mL beaker	any		For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media
DMEM	Corning
Flow chamber + rubber gasket	Glycotech	31-001	Circular Flow chamber Kit ( for 35 mm tissue culture dishes)
Hybrid Rheometer	HR-2 Discovery Hybrid Rheometer		For determination of shear fluid viscosity
magnetic stir bar	any		For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media
magnetic stir plate	any		For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media
methyl cellulose	any		To increase viscosity of DMEM in flow media
Syringe Pump	KD Scientific Geminin 88 plus	788088	For programming fluid infusion and withdrawal
syringes, tubing, and connectors			For shear apparatus setup
SOFTWARE
ABAQUS software	Simulia
Digitial Image Correlation software	LaVision, Germany	DAVIS 10.1.2
Imaging software	Leica/any microscope software
MATLAB	MATLAB	MATLAB_R2020B