Grundlegendes dreidimensionales (3D) Darmmodellsystem mit einer Immunkomponente

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir die Konstruktion eines grundlegenden dreidimensionalen (3D) intestinalen Zelllinienmodellsystems und eines Paraffin-Einbettungsprotokolls für die lichtmikroskopische Bewertung von fixierten intestinalen Äquivalenten. Die Färbung ausgewählter Proteine ermöglicht die Analyse mehrerer visueller Parameter aus einem einzigen Experiment für den potenziellen Einsatz in präklinischen Wirkstoff-Screening-Studien.

Zusammenfassung

Die Verwendung von In-vivo - und In-vitro-Darmmodellen zur Untersuchung der Pathophysiologie entzündlicher Darmerkrankungen, zum pharmakologischen Screening potenziell nützlicher Substanzen und zur Toxizitätsuntersuchung potenziell schädlicher Lebensmittelbestandteile hat zugenommen. Relevant ist, dass derzeit ein Bedarf an der Entwicklung von zellbasierten In-vitro-Modellen besteht, um Tiermodelle zu ersetzen. Hier wird ein Protokoll für ein grundlegendes, dreidimensionales (3D) intestinales Äquivalentmodell aus "gesundem Gewebe" unter Verwendung von Zelllinien vorgestellt, das sowohl experimentelle Einfachheit (standardisiertes und leicht wiederholbares System) als auch physiologische Komplexität (Caco-2-Enterozyten mit einer unterstützenden Immunkomponente von U937-Monozyten und L929-Fibroblasten) bietet. Das Protokoll beinhaltet auch eine Paraffineinbettung zur lichtmikroskopischen Auswertung von fixierten Darmäquivalenten, wodurch der Vorteil der Analyse mehrerer visueller Parameter in einem einzigen Experiment geboten wird. Hämatoxylin- und Eosin-gefärbte (H&E)-gefärbte Schnitte, die zeigen, dass die Caco-2-Säulenzellen eine dichte und regelmäßige Monoschicht in Kontrollbehandlungen bilden, werden verwendet, um die Wirksamkeit des Modells als experimentelles System zu überprüfen. Zu den Parametern, die aus den Schnitten analysiert wurden, gehören eine reduzierte Monoschichtdicke sowie eine Störung und Ablösung von der zugrunde liegenden Matrix (H&E), eine verminderte Expression von Tight-Junction-Proteinen, wie sie aus der Occludin-Färbung (statistisch quantifizierbar) hervorgeht, und die Immunaktivierung migrierender U937-Zellen, wie sie durch die Cluster-of-Differentiation 14 (CD14)-Färbung und die CD11b-bezogene Differenzierung in Makrophagen nachgewiesen wird. Wie die Verwendung von Lipopolysaccharid zur Simulation einer Darmentzündung zeigt, sind zusätzliche Parameter, die gemessen werden können, eine erhöhte Schleimfärbung und Zytokinexpression (z. B. Midkin), die vor der Fixierung aus dem Medium extrahiert werden können. Das grundlegende dreidimensionale (3D) Darmschleimhautmodell und die fixierten Schnitte können für Studien zum Entzündungsstatus und zur Barriereintegrität empfohlen werden, wobei die Möglichkeit besteht, mehrere visuell quantifizierbare Parameter zu analysieren.

Einleitung

Die intestinale Epithelbarriere, eine eine Zelle dicke innere Auskleidung, die verschiedene Arten von Epithelzellen enthält, stellt die erste physikalische Abwehrbarriere oder Schnittstelle zwischen dem äußeren und dem inneren Milieu des Körpers dar ^1,2. Enterozyten vom Säulentyp stellen die am häufigsten vorkommende Art von Epithelzellen dar. Diese sind für die Aufrechterhaltung der Integrität der epithelialen Barriere durch Wechselwirkungen zwischen mehreren Barrierekomponenten, einschließlich Tight Junctions (TJs), verantwortlich und spielen eine wichtige Rolle bei der Straffung der Barriere

Protokoll

1. Erstellung des grundlegenden 3D-rekonstruierten Darmschleimhautmodells

HINWEIS: Das gesamte Verfahren muss in einer sterilen Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden. Alle Schritte des Verfahrens, bei denen der Zellinkubator verwendet wird, bedeuten, dass die Kulturen bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ inkubiert werden (sofern im Protokoll nicht anders angegeben_).

1. Vorherige Präparation der im Darmmodellsystem verwendeten Zelllinien
   1. L929-Maus-Fibroblastenzellen in einer Konzentration von 5 x 10⁵ in 5 ml des modifizierten Eagle-Mediums (DMEM) von Dulbecco, das 2 mM L-Gluta....

Diskussion

Das hier vorgestellte grundlegende rekonstruierte Modellsystem der Darmschleimhaut (Abbildung 6) kombiniert physiologische Komplexität (physiologisch relevantere 3D-Zellkulturen, die eine Caco-2-Monoschicht mit einem EZM-reichen Lamina-propria-Träger mit Fibroblasten und Monozyten enthalten) mit experimenteller Einfachheit (Verwendung kommerzieller humaner Zelllinien zur Herstellung eines standardisierten und leicht wiederholbaren Systems)¹³. Daher wird dieses Model.......