Aufbereitung von harten Palmsamen für die matrixgestützte Laserdesorptions-/Ionisations-Imaging-Massenspektrometrie-Analyse

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zielte darauf ab, detaillierte Leitlinien für die Vorbereitung von harten Saatgutprobenschnitten mit niedrigem Wassergehalt für die MALDI-IMS-Analyse zu beschreiben, die ursprüngliche Verteilung und Häufigkeit der Analyten beizubehalten und eine qualitativ hochwertige Signal- und räumliche Auflösung bereitzustellen.

Zusammenfassung

Die Matrix-unterstützte Laser-Desorptions-/Ionisations-Imaging-Massenspektrometrie (MALDI-IMS) wird angewendet, um Verbindungen in ihrer natürlichen Umgebung zu identifizieren. Derzeit wird MALDI-IMS häufig in der klinischen Analyse eingesetzt. Dennoch gibt es eine hervorragende Perspektive, um diese Technik besser anzuwenden, um die physiologischen Informationen chemischer Verbindungen in Pflanzengeweben zu verstehen. Die Vorbereitung kann jedoch für bestimmte Proben aus botanischen Materialien eine Herausforderung darstellen, da MALDI-IMS dünne Scheiben (12-20 μm) für eine angemessene Datenerfassung und erfolgreiche Analyse benötigt. In diesem Sinne haben wir zuvor ein Probenvorbereitungsprotokoll entwickelt, um dünne Schnitte von harten Samen von Euterpe oleracea (Açaí-Palme) zu erhalten, die ihre molekulare Kartierung durch MALDI-IMS ermöglichen.

Hier zeigen wir, dass das entwickelte Protokoll für die Herstellung anderer Samen derselben Gattung geeignet ist. Kurz gesagt, das Protokoll basierte darauf, die Samen 24 Stunden lang in deionisiertes Wasser zu tauchen, Proben mit Gelatine einzubetten und sie in einem akklimatisierten Kryostaten zu schneiden. Für die Matrixabscheidung wurde dann eine xy-Bewegungsplattform mit einem Elektrospray-Ionisationsnadelspray (ESI) unter Verwendung einer 1:1 (v/v) 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB) und einer Methanollösung mit 0,1% Trifluoressigsäure bei 30 mg/ml gekoppelt. Die Samendaten von E. precatoria und E. edulis wurden mit Hilfe von Software verarbeitet, um ihre Metabolitenmuster abzubilden.

Hexose-Oligomere wurden in Probenscheiben kartiert, um die Angemessenheit des Protokolls für diese Proben zu beweisen, da bekannt ist, dass diese Samen große Mengen an Mannan, einem Polymer der Hexose-Mannose, enthalten. Als Ergebnis wurden Peaks von Hexose-Oligomeren, dargestellt durch [M + K]⁺ Addukte von (Δ = 162 Da), identifiziert. So ermöglichte das zuvor speziell für E. oleracea-Samen entwickelte Probenvorbereitungsprotokoll auch die MALDI-IMS-Analyse von zwei weiteren harten Palmsamen. Kurz gesagt, die Methode könnte ein wertvolles Werkzeug für die Erforschung der Morphoanatomie und Physiologie botanischer Materialien sein, insbesondere aus schnittfesten Proben.

Einleitung

Die Matrix-unterstützte Laserdesorptions-/Ionisations-Imaging-Massenspektrometrie (MALDI-IMS) ist eine leistungsfähige Methode, die eine zweidimensionale Zuordnung von Biomolekülen ermöglicht, eine ungezielte Untersuchung ionisierbarer Verbindungen ermöglicht und deren räumliche Verteilung, insbesondere in biologischen Proben, bestimmt ^1,2. Seit zwei Jahrzehnten ermöglicht diese Technik den gleichzeitigen Nachweis und die Identifizierung von Lipiden, Peptiden, Kohlenhydraten, Proteinen, anderen Metaboliten und synthetischen Molekülen wie therapeutischen Medikamenten ^3,4

Protokoll

Die Samen der Euterpe precatoria wurden freundlicherweise vom Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (Manaus, Brasilien) gespendet, und die Samen von Euterpe edulis wurden freundlicherweise vom Silo - Arte e Latitude Rural (Resende, Brasilien) nach dem industriellen Entpulpungsprozess gespendet. Die Samen wurden in verschlossenen Plastikboxen bei Raumtemperatur aufbewahrt.

1. Matrix-unterstützte Laserdesorptions-/Ionisations-Imaging-Massenspektroskopie (MALDI-IMS)

1. Protokoll der Saatgutsektion
   1. Lassen Sie drei Samen jeder Art 24 Stunden lang in deionisiertem Wasser ruhen.
   2. Sch....

Ergebnisse

Das entwickelte Protokoll ermöglichte die MALDI-IMS-Analyse von E . precatoria - und E. edulis-Samen . Als Ergebnis konnten wir das Molekulargewicht und den Polymerisationsgrad (DP) von Kohlenhydraten als partielle Strukturaufklärung bestätigen. Die molekularen Informationen, die durch die MALDI-IMS-Analyse (Abbildung 1 und Abbildung 2) geliefert wurden, zeigten Peaks, die [M+K]⁺ Addukte von Hexose-Oligomeren (Δ .......

Diskussion

Pflanzen bestehen aus spezialisierten Geweben für bestimmte biochemische Funktionen. Daher muss das Probenvorbereitungsprotokoll für MALDI-IMS entsprechend verschiedenen Pflanzengeweben mit spezifischen physikalisch-chemischen Eigenschaften entworfen werden, da die Proben ihre ursprüngliche Analytverteilung und -häufigkeit für eine qualitativ hochwertige Signal- und räumliche Auflösung beibehalten müssen⁸.

Vor der MALDI-IMS-Analyse geht es in erster Linie darum,.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Gastight Syringe Model 1001 TLL, PTFE Luer Lock	Hamilton Company	81320
2,5-Dihydroxybenzoic acid	Sigma Aldrich Co, MO, USA	149357
APCI needle	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	602193
AxiDraw V3 xy motion platform	Evil Mad Scientist, CA, USA	2510
Carbon double-sided conductive tape
Compass Data Analysis software			creation of mass list
Compressed air
copper double-faced adhesive tape	3M, USA	1182-3/4"X18YD
Cryostat CM 1860 UV	Leica  Biosystems, Nussloch, Germany
Diamond Wafering Blade 15 HC
Everhart-Thornley detector
FlexImaging	Bruker Daltonik, Bremen, Germany		image acquisition
FTMS Processing	Bruker Daltonik, Bremen, Germany		data calibration
Gelatin from bovine skin	Sigma Aldrich Co, MO, USA	G9391
High Profile Microtome Blades Leica 818	Leica  Biosystems, Nussloch, Germany	0358 38926
indium tin oxide coated glass slide	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	8237001
Inkscape	Inkscape Project c/o Software Freedom Conservancy, NY, USA
IsoMet 1000 precision cutter	Buehler, Illinois, USA
Methanol	J.T.Baker	9093-03
Mili-Q water			18.2 MΩ.cm
Oil vacuum pump
Optimal Cutting Temperature Compound	Fisher HealthCare, Texas, USA	4585
Parafilm "M" Sealing Film	Amcor	HS234526B
Quanta 450 FEG	FEI Co, Hillsboro, OR, USA
SCiLS Lab (Multi-vendor support) MS Software	Bruker Daltonik, Bremen, Germany
Software INCA Suite 4.14 V	Oxford Instruments, Ableton, UK
Solarix 7T	Bruker Daltonik, Bremen, Germany
Syringe pump	kdScientific, MA, USA	78-9100K
Trifluoroacetic acid	Sigma Aldrich Co, MO, USA	302031
X-Max spectrometer	Oxford Instruments, Ableton, UK