Ein automatisiertes Kultursystem zur Erhaltung und Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll für ein automatisiertes Zellkultursystem vor. Dieses automatisierte Kultursystem reduziert den Arbeitsaufwand und kommt den Anwendern zugute, einschließlich Forschern, die mit dem Umgang mit induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) nicht vertraut sind, von der Wartung von iPS-Zellen bis hin zur Differenzierung in verschiedene Zelltypen.

Zusammenfassung

Es wird erwartet, dass humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs) mit unendlicher Selbstproliferationsfähigkeit in zahlreichen Bereichen Anwendung finden, darunter die Aufklärung seltener Krankheiten, die Entwicklung neuer Medikamente und die regenerative Medizin zur Wiederherstellung geschädigter Organe. Trotzdem ist die gesellschaftliche Umsetzung von hiPSCs noch begrenzt. Dies liegt zum Teil daran, dass es schwierig ist, die Differenzierung in der Kultur zu reproduzieren, selbst mit fortgeschrittenem Wissen und ausgefeilten technischen Fähigkeiten, was auf die hohe Empfindlichkeit von iPS-Zellen gegenüber winzigen Umweltveränderungen zurückzuführen ist. Die Anwendung eines automatisierten Kultursystems kann dieses Problem lösen. Experimente mit hoher Reproduzierbarkeit, unabhängig von den Fähigkeiten eines Forschers, können nach einem gemeinsamen Verfahren über verschiedene Institute hinweg erwartet werden. Obwohl bereits mehrere automatisierte Kultursysteme entwickelt wurden, die iPSC-Kulturen aufrechterhalten und eine Differenzierung induzieren können, sind diese Systeme schwer, groß und kostspielig, da sie humanisierte, mehrgliedrige Roboterarme verwenden. Um die oben genannten Probleme zu verbessern, haben wir ein neues System entwickelt, das ein einfaches G-Y-Z-Achsen-Gleitschienensystem verwendet, das es kompakter, leichter und kostengünstiger macht. Darüber hinaus kann der Benutzer Parameter im neuen System einfach ändern, um neue Handhabungsaufgaben zu entwickeln. Sobald eine Aufgabe eingerichtet ist, muss der Benutzer nur noch den iPSC vorbereiten, die für die gewünschte Aufgabe benötigten Reagenzien und Verbrauchsmaterialien im Voraus bereitstellen, die Aufgabennummer auswählen und die Uhrzeit angeben. Wir bestätigten, dass das System iPS-Zellen über mehrere Passagen ohne Feederzellen in einem undifferenzierten Zustand halten und sich in verschiedene Zelltypen differenzieren kann, darunter Kardiomyozyten, Hepatozyten, neurale Vorläuferzellen und Keratinozyten. Das System wird hochgradig reproduzierbare Experimente zwischen Institutionen ermöglichen, ohne dass qualifizierte Forscher erforderlich sind, und es wird die soziale Implementierung von hiPSCs in einem breiteren Spektrum von Forschungsfeldern erleichtern, indem es die Hindernisse für neue Markteintritte verringert.

Einleitung

Dieser Artikel zielt darauf ab, aktuelle und detaillierte Handhabungsverfahren für ein automatisiertes Kultursystem für humane induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC), das wir in Zusammenarbeit mit einem Unternehmen hergestellt haben, vorzustellen und repräsentative Ergebnisse zu zeigen.

Seit der Veröffentlichung des Artikels im Jahr 2007 erregt iPSC weltweit Aufmerksamkeit¹. Aufgrund seiner größten Eigenschaft, sich in jede Art von Körperzellen differenzieren zu können, wird erwartet, dass es in verschiedenen Bereichen wie der regenerativen Medizin, der Aufklärung der Ursachen hartnäckiger Krankheiten und der Ent....

Protokoll

Die Ethikkommission der Kansai Medical University genehmigte die Generierung und Verwendung der gesunden iPS-Zellen aus Freiwilligen mit dem Namen KMUR001 (Zulassung Nr. 2020197). Der Spender, der offen rekrutiert wurde, gab eine formelle Einverständniserklärung ab und stimmte der wissenschaftlichen Verwendung der Zellen zu.

HINWEIS: Die aktuelle Benutzeroberfläche (die spezielle Software mit dem Namen "ccssHMI", die unter dem Betriebssystem Windows XP läuft) ist der grundlegende Bedienbildschirm. Unter der oben genannten Schnittstelle sind eine Reihe von Registerkarten angeordnet, mit denen Benutzer verschiedene Vorgänge einleiten können.<....

Diskussion

Ein wichtiger Schritt im Protokoll besteht darin, dass ein Benutzer, wenn er Fehler findet, jederzeit auf die Schaltfläche "Abbrechen", "Beenden" oder "Zurücksetzen" klicken und mit dem ersten Schritt beginnen kann. Die Software kann menschliche Fehler vermeiden, wie z. B. Doppelbuchungen, das Öffnen von Türen, während die Systemaufgaben aktiv sind, und mangelnden Nachschub. Ein weiterer kritischer Punkt für eine erfolgreiche und effiziente Differenzierung zur gewünschten somatischen Zelle ist die richtige Auswahl.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.15% bovine serum albumin fraction V	Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan	9048-46-8
1% GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061
10 cm plastic plates	Corning Inc., NY, United States	430167
253G1	RKEN Bioresource Research Center	HPS0002
2-mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	21985023
Actinin  mouse	Abcam	ab9465
Activin A	Nacali Tesque	18585-81
Adenine	Thermo Fisher Scientific	A14906.30
Albumin  rabbit	Dako	A0001
All-trans retinoic acid	Fuji Film Wako Chemical Inc.	186-01114
Automated culture system	Panasonic
B-27 supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044
bFGF	Fuji Film Wako Chemical Inc.	062-06661
BMP4	Thermo Fisher Scientific	PHC9531
Bovine serum albumin	Merck	810037
CHIR-99021	MCE, NJ, United States #HY-10182	252917-06-9
Defined Keratinocyte-SFM	Thermo Fisher Scientific	10744019	Human keratinocyte medium
Dexamethasone	Merck	266785
Dihexa	TRC, Ontario, Canada	13071-60-8	rac-1,2-Dihexadecylglycerol
Disposable hemocytometer	CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific	C10228
Dorsomorphin	Thermo Fisher Scientific	1219168-18-9
Dulbecco’s modified Eagle medium/F12	Fuji Film Wako Chemical Inc.	12634010
EGF	Fuji Film Wako Chemical Inc.	053-07751
Essential 8	Thermo Fisher Scientific	A1517001	Human pluripotent stem cell medium
Fetal bovine serum	Biowest, FL, United States	S140T
FGF-basic	Nacalai Tesque Inc.	19155-07
Forskolin	Thermo Fisher Scientific	J63292.MF
Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081	Glutamine supplement
Goat IgG(H+L) AlexaFluo546	Thermo Scientific	A11056
HNF-4A  goat	Santacruz	6556
Hydrocortisone	Thermo Fisher Scientific	A16292.06
Hydrocortisone 21-hemisuccinate	Merck	H2882
iMatrix511 Silk	Nippi Inc., Tokyo, Japan	892 021	Cell culture matrix
Insulin-transferrin-selenium	Thermo Fisher Scientific	41400045
Keratin 1  mouse	Santacruz	376224
Keratin 10  rabbit	BioLegend	19054
KMUR001	Kansai Medical University		Patient-derived iPSCs
Knockout serum replacement	Thermo Fisher Scientific	10828010
L-ascorbic acid 2-phosphate	A8960, Merck	A8960
Leibovitz’s L-15 medium	Fuji Film Wako Chemical Inc.	128-06075
Matrigel	Corning Inc.	354277
Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488	Thermo Scientific	A21202
N-2 supplement	Thermo Fisher Scientific	17502048
Nestin mouse	Santacruz	23927
Neurobasal medium	Thermo Fisher Scientific	21103049
Neurofilament  rabbit	Chemicon	AB1987
Neutristem	Sartrius AG, Göttingen, Germany	05-100-1A	cell culture medium
Oct 3/4  mouse	BD	611202
PBS(-)	Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan	14249-24
Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488	Thermo Scientific	A21206
Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546	Thermo Scientific	A10040
Recombinant human albumin	A0237, Merck, Darmstadt, Germany	A9731
Rho kinase inhibitor, Y-27632	Sellec Inc., Tokyo, Japan	129830-38-2
RIKEN 2F	RKEN Bioresource Research Center	HPS0014	undifferentiated hiPSCs
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific #11875	12633020
SB431542	Thermo Fisher Scientific	301836-41-9
Sodium L-ascorbate	Merck	A4034-100G
SSEA-4  mouse	Millipore	MAB4304
StemFit AK02N	Ajinomoto, Tokyo, Japan	AK02	cell culture medium
TnT rabbit	Abcam	ab92546
TRA 1-81 mouse	Millipore	MAB4381
Triiodothyronine	Thermo Fisher Scientific	H34068.06
TripLETM express enzyme	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States	12604013
Trypan blue solution	Nacalai Tesque, Kyoto, Japan	20577-34
Tryptose phosphate broth	Merck	T8782-500G
Wnt-C59	Bio-techne, NB, United Kingdom	5148
β  Tublin  mouse	Promega	G712A