Dioszin-vermittelte Linderung der IgA-Nephropathie durch Hemmung der B-Zell-Aktivierung in vivo und Verringerung der Galaktose-defizienten IgA1-Produktion in vitro

Zusammenfassung

Diese Studie liefert experimentelle Daten zur Behandlung der Immunglobulin-A-Nephropathie (IgAN) mit Dioscin (DIO), dem Wirkstoff des Dioscoreae Nipponicae Rhizoma (DNR), und ein Paradigma für die Untersuchung der Wirkungen der Pflanzenheilkunde und der zugrunde liegenden Mechanismen in vivo und in vitro.

Zusammenfassung

Der Anstieg des zirkulierenden Galaktose-defizienten IgA1 (Gd-IgA1) wird durch eine übermäßige Aktivierung von IgA-positiven sekretorischen Zellen im Prozess der mukosalen Immunantwort verursacht, was ein kritisches Glied in der Pathogenese der IgA-Nephropathie (IgAN) darstellt. Das Peyer-Pflaster, die prominente Stelle, an der B-Lymphozyten in IgA-sezernierende Plasmazellen umgewandelt werden, ist die Hauptquelle für IgA. Darüber hinaus steht die geringere Expression der kernigen 1β-1,3-Galactosyltransferase (C1GalT1) und ihres molekularen Chaperons, des C1GalT1-spezifischen molekularen Chaperons (Cosmc), im Zusammenhang mit einer abnormalen Glykosylierung von IgA1 bei IgAN-Patienten. Unsere klinische Erfahrung zeigt, dass das pflanzliche Arzneimittel von Dioscoreae Nipponicae Rhizoma (DNR) Proteinurie und Hämaturie lindern und die Nierenfunktion bei IgAN-Patienten verbessern kann. Dioscin (DIO) ist einer der Hauptwirkstoffe von DNR, der verschiedene pharmakologische Aktivitäten hat. In dieser Studie wird der mögliche Mechanismus von DIO bei der Behandlung von IgAN untersucht.Die IgAN-Modellmaus wurde durch mukosale Immuninduktion etabliert. Die Mäuse wurden in die Kontroll-, Modell- und DIO-Sondengruppe eingeteilt. Die glomeruläre IgA-Ablagerung bei Mäusen, pathologische Veränderungen der Nieren und die B-Zell-Marker CD20 und CXCR5 in Peyers Patch wurden durch Immunfluoreszenz und Immunhistochemie nachgewiesen. Nach der Stimulation durch Lipopolysaccharid (LPS) wurden die Auswirkungen von DIO auf die Proliferation von DAKIKI-Zellen, die IgA- und Gd-IgA1-Sekretion, C1GalT1 und die Cosmc-Expression mittels Cell Counting Kit-8 (CCK-8)-Assay, ELISA-Test (Enzyme-linked Immunosorbent Assay), quantitativer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (QRT-PCR) und Western Blotting (WB) untersucht. In in vivo Studien wurde die IgA-Ablagerung, begleitet von einer glomerulären mesangialen Hyperplasie und einer erhöhten Expression von CD20 und CXCR5 im Peyer-Patch in der IgAN-Modellmaus, durch DIO gemildert. In-vitro-Studien zeigten, dass 0,25 μg/ml bis 1,0 μg/ml DIO die LPS-induzierte DAKIKI-Zellproliferation, die IgA- und Gd-IgA1-Sekretion hemmten und die mRNA- und Proteinexpression von C1GalT1 und Cosmc hochregulierten. Diese Studie zeigt, dass DIO die Gd-IgA1-Produktion reduzieren kann, indem es die übermäßige Aktivierung von IgA-sezernierenden Zellen hemmt und die C1GALT1/Cosmc-Expression hochreguliert.

Einleitung

Die IgA-Nephropathie (IgAN) ist die häufigste Form der primären Glomerulonephritis, für die es keine spezifische Behandlung gibt, und sie ist nach wie vor eine wichtige Ursache für Nierenerkrankungen im Endstadium¹. Obwohl die Pathogenese von IgAN noch nicht vollständig verstanden ist, wird die "Multi-Hit-Hypothese" allgemein akzeptiert und durch eine große Anzahl klinischer und experimenteller Forschungsergebnisse gestützt². Die Pathogenese von IgAN beinhaltet die Aktivierung von B-Zellen und die Produktion von Galactose-defizientem IgA1 (Gd-IgA1)³. Die Zunahme des zirkulierenden Gd-IgA1 aufgrund der übermäßigen Proliferation und Aktivierung von IgA-sezernierenden Zellen während der mukosalen Immunantwort ist ein kritisches Glied in der Pathogenese von IgAN ^4,5,6. Als zentraler Ort für die Proliferation und Aktivierung der Umwandlung des B-Lymphozyten-Phänotyps in IgA-sezernierende Zellen ist das Peyer-Pflaster die primäre Quelle für die IgA-Sekretion, die eng mit dem Auftreten und der Entwicklung von IgAN zusammenhängt ^7,8. Darüber hinaus waren die Proliferation von IgA1-sezernierenden Zellen sowie die Expression von Core 1β-1,3-Galactosyltransferase (C1GalT1) und C1GalT1-spezifischem molekularem Chaperon (Cosmc) mit einer abnormalen Glykosylierung von IgA1 verbunden, die bei IgAN-Patienten eine GD-IgA1-Produktion verursacht ^6,9.

Die klinische Studie zur Behandlung von IgAN mit pflanzlichen Arzneimitteln hat in den letzten Jahren Fortschritte gemacht. Die Yiqi Qingjie-Formel ist eine essentielle Formel zur Behandlung von IgAN durch die Abteilung für Nephrologie des Guang'anmen-Krankenhauses. Die vorherige Studie unserer Gruppe ergab, dass Gd-IgA1 im Serum von IgAN-Patienten nach der Behandlung mit Yiqi Qingjie Formula abnahm. Als eines der am häufigsten verwendeten Kräuter in der Yiqi Qingjie-Formel ist Dioscoreae Nipponicae Rhizoma (DNR) das getrocknete Rhizom von Dioscorea Nipponica Makino, das verschiedene Funktionen wie die Regulierung der Immunität, die Unterdrückung von Entzündungen, die Linderung von Husten und Asthma hat^10,11. Mehrere Gelehrte behandelten IgAN mit DNR und erzielten gute Ergebnisse 12,13,14. Als Hauptwirkstoff in DNR¹⁵ senkt Dioscin (DIO) die Harnsäure, hemmt die Fibrose, hemmt die Entzündungsreaktion und antioxidativen Stress^16,17. Daher könnte DIO einen neuartigen Wirkmechanismus aufweisen, um die zelluläre Sekretion von überschüssigem Gd-IgA1 zu hemmen und spezifische Nierenschutzeffekte auszuüben. Dennoch wurde keine Studie über den Wirkmechanismus von DIO bei der Behandlung von IgAN berichtet.

Um den potenziellen therapeutischen Mechanismus von DIO auf IgAN zu erforschen und eine neue Methode für die Behandlung von IgAN bereitzustellen, haben wir Experimente zu den therapeutischen Effekten von DIO auf IgAN in vivo und in vitro durchgeführt.

Protokoll

Die Ethikkommission des Guanganmen-Krankenhauses genehmigte dieses Experiment (ethische Genehmigungsnummer für Tierversuche: IACUC-GAMH-2023-003).

1. Vorbereitung der Mäuse auf das experimentelle Verfahren

1. Ziehen Sie 22 männliche Balb/c-Mäuse mit Lichtschutzfaktor (6-7 Wochen alt, Körpergewicht 20-25 g) in der Tiereinrichtung des Krankenhauses/Forschungszentrums auf. Teilen Sie die Tiere mit der Zufallstabellenmethode in Kontroll- (n = 8) und Modellgruppen (n = 14) ein.
2. Nach 1 Woche adaptiver Aufzucht im Laborkäfig füttern Sie die Modellgruppe (IgAN-Gruppe) 9 Wochen lang mit 0,1%iger Rinder-Gammaglobulin-Lösung (BGG) in angesäuertem Wasser mit einem Gehalt von 6 mmol/L HCl gemäß dem Modellierungsprotokoll von Zou et ^al.18.
3. Injizieren Sie 0,1 ml 0,1% ige BGG-Lösung in Kochsalzlösung in die Schwanzvene an 3 aufeinanderfolgenden Tagen, während Sie weiterhin BGG-Lösung trinken, um ein IgAN-Versuchsmaus Modell¹⁸ vorzubereiten.
4. Lassen Sie die Kontrollgruppe 9 Wochen lang frei 6 mmol/L HCl gesäuertes Wasser ohne BGG trinken. Injizieren Sie das entsprechende Volumen Kochsalzlösung für aufeinanderfolgende 3 Tage in die Schwanzvene.
   HINWEIS: Die Kontroll- und Modellgruppen wurden in der gleichen Qualität wie normales Futter gefüttert.
5. Nach der Schwanzveneninjektion wählen Sie nach dem Zufallsprinzip 2 Mäuse in der Kontrollgruppe und 2 Mäuse in der Modellgruppe aus und untersuchen sie mittels Proteinurie, Lichtmikroskopie und Immunfluoreszenz, um festzustellen, ob die Modellierung erfolgreich war.
   HINWEIS: Den Tieren wird kein Futter zur Verfügung gestellt, aber es ist ihnen nicht verboten, Wasser zu trinken. Zeichnen Sie die Urinausscheidung auf.
6. Sammeln Sie den Urin für 24 h in Stoffwechselkäfigen und zentrifugieren Sie ihn 5 Minuten lang bei 400 x g ; Entsorgen Sie Urinsedimente. Nach einer 10-fachen Verdünnung des Überstands ist die Proteinurie-Konzentration mit einem Urinprotein-Assay-Kit zu messen und dann mit dem Verdünnungsfaktor und dem Urinvolumen zu multiplizieren, um 24 h Gesamturinprotein zu erhalten.
   HINWEIS: Mikroskopie und Immunfluoreszenzmethoden sind in den Abschnitten 3 bzw. 4 dargestellt.
7. Nach erfolgreicher Vorbereitung des Modells teilen Sie 12 Mäuse der Modellgruppe in 6 Mäuse auf, jeweils in der Modellgruppe (IgAN-Gruppe) und der DIO-Sondengruppe (DIO-Gruppe), nach der Zufallszahltabellenmethode.
8. Die Kontrollgruppe trinke weiterhin 6 mmol/L HCl angesäuertes Wasser ohne BGG und die Modellgruppe 0,1% ige BGG-Lösung, die aus angesäuertem Wasser mit 6 mmol/L HCl besteht. Berechnen Sie die Dosis der Verabreichung einer DIO-Gruppensonde gemäß der Dosisumwandlungsformel der pharmakologischen experimentellen Methodik (umgerechnet nach der menschlichen Körpermasse von 70 kg)¹⁹. Sonde DIO Tabletten 0,06 g/kg einmal täglich für 8 Wochen.
9. Nach 8-wöchiger Sonde werden die Mäuse intraperitoneal mit 0,4 % Pentobarbital-Natrium (60 mg/kg) betäubt und nach Bestätigung der ordnungsgemäßen Anästhesie durch Zehenkneifen die Nieren und das Peyer-Pflaster für nachfolgende lichtmikroskopische und immunhistochemische Analysen isoliert.
   HINWEIS: Das Schema für das In-vivo-Modell ist in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt.

2. Histologische Analyse

1. Paraffinschnitte für Nieren und Peyer-Pflaster
   1. 3 mm dickes Nierengewebe oder 1 Peyer-Pflaster mit 4% Paraformaldehyd 24 h fixieren, mit Gradientenethanol und Xylol dehydrieren. 2 h in Wachs tauchen, versiegeln und einfrieren.
   2. Schneiden Sie 2 μm dicke Nierenschnitte und 4 μm dicke Peyer-Patch-Abschnitte ab und verteilen Sie sie in warmem Wasser. Die entfalteten Scheiben mit einem sauberen Glasschieber aufheben und im Backofen bei konstanter Temperatur bei 40 °C 1 h backen. Beginnen Sie mit der Färbung nach der Vorbearbeitung der Probe.
      HINWEIS: Nehmen Sie die koronale Oberfläche des hilären Teils der Niere mit einer Dicke von 3 mm Gewebeblock.
2. Entwachsen und färben Sie die Paraffinabschnitte bei Raumtemperatur (RT) für 10 Minuten mit periodischer saurer Lösung, wobei Sie Licht vermeiden sollten. Mit destilliertem Wasser abspülen und die Flecken 20-30 Minuten lang trocken wischen, dabei Licht vermeiden. Spülen Sie mit destilliertem Wasser ab, bis die Schnitte unter dem Mikroskop rot sind.
3. Legen Sie die Schnitte in Hämatoxylin-Färbelösung, färben Sie die Kerne 3 Minuten lang (zu tief gefärbte Zellkerne können durch Ethanolhydrochlorid geteilt werden) und spülen Sie sie mit fließendem Wasser ab, bis die Objektträger farblos sind.
4. Führen Sie eine routinemäßige Dehydrierung mit Gradientenkonzentrationen von Ethanol und Xylol durch, versiegeln Sie die Schnitte mit neutralem Gummi und betrachten Sie sie unter einem Mikroskop. PAS-positiv ist rot und der Zellkern blau.

3. Immunhistochemische Analyse des Peyer-Pflasters

1. Bereiten Sie Paraffinabschnitte des Peyer-Pflasters vor, wie in Schritt 2.1 beschrieben.
   HINWEIS: Die Dicke der Schnitte für die immunhistochemische und anschließende Immunfluoreszenz beträgt 4 μm.
2. Entwachse die Paraffinabschnitte:
   1. Legen Sie die Schnitte für 5 min in Xylol I, 5 min in Xylol II und 5 min in Xylol III.
   2. Spülen Sie die Objektträger weiterhin 5 min lang mit wasserfreiem Ethanol I, 5 min mit wasserfreiem Ethanol II, 5 min mit 85 % Alkohol und 5 min mit 75 % Alkohol. Spülen Sie dann die Objektträger in destilliertem Wasser ab.
3. Antigen-Rückgewinnung
   1. Bereiten Sie eine 50%ige Stammlösung von Natriumcitrat vor und verdünnen Sie sie mit destilliertem Wasser auf 1x zur Verwendung. Erhitzen Sie es 2 Minuten lang in einem Autoklaven und legen Sie dann die Scheiben in den Autoklaven, wobei Sie darauf achten, dass der Flüssigkeitsstand den Wert der Scheiben übersteigt.
   2. 5 Minuten bei hoher Temperatur erhitzen, dann die Objektträger natürlich abkühlen lassen. Waschen Sie die Scheiben dreimal mit PBS-Lösung für jeweils 5 Minuten.
4. Blockierung der endogenen Peroxidase: Markieren Sie die Ränder des Gewebes in einem Kreis mit einem immunhistochemischen Stift. Inkubieren Sie die Schnitte 15 Minuten lang in 3%iger Wasserstoffperoxidlösung bei RT, geschützt vor Licht, und waschen Sie die Schnitte dreimal jeweils 5 Minuten lang mit PBS-Lösung.
5. Serumblockierung: Blockieren Sie die Abschnitte, indem Sie 10 % Ziegenserum auf die markierten Gewebeabschnitte für 30 Minuten bei RT tropfen. Stellen Sie sicher, dass die Abschnitte gleichmäßig mit dem Fleck bedeckt sind.
6. Inkubation des Primärantikörpers: Schütteln Sie die Blockierungslösung vorsichtig ab und fügen Sie einen Teil des vorbereiteten Primärantikörpers (CD20 [1:800]; CXCR5 [1:800]) an den Abschnitt an. Legen Sie das Profil flach in eine Nassbox und inkubieren Sie es über Nacht bei 4 °C.
   HINWEIS: Geben Sie eine kleine Menge Wasser in die Nassbox, um eine Verdunstung des Antikörpers zu verhindern.
7. Inkubation von Sekundärantikörpern: Waschen Sie die Schnitte dreimal 5 Minuten lang mit PBS-Lösung. Entfernen Sie PBS, indem Sie die Schnitte trocken schütteln, bedecken Sie das Gewebe mit einem Tropfen Sekundärantikörper (HRP-Markierung) der verwandten Spezies des Primärantikörpers und inkubieren Sie es 50 Minuten lang bei RT.
8. 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) Homogenisierung: Waschen Sie die Schnitte dreimal für jeweils 5 min mit PBS-Lösung. Nachdem Sie die Schnitte trocken geschüttelt haben, geben Sie die frisch zubereitete DAB-Chromogenlösung auf die Schnitte. Beobachten Sie die Farbentwicklungszeit unter dem Mikroskop; Das Positiv ist bräunlich-gelb. Mit Leitungswasser nachspülen, um die Farbentwicklung zu stoppen.
9. Färben der Zellkerne: Färben Sie erneut mit Hämatoxylin für ca. 1 min., waschen Sie es mit Leitungswasser und spülen Sie es dann 10 min lang mit Leitungswasser ab, um wieder blau zu werden.
10. Dehydrierung und Versiegelung:
    1. Legen Sie die Abschnitte 5 min lang in 75 % Alkohol und 5 min in 85 % Alkohol. Legen Sie die Abschnitte 5 min lang in wasserfreies Ethanol I, 5 min in wasserfreies Ethanol II und 5 min in wasserfreies Ethanol III.
    2. Die Abschnitte 5 min in Xylol I waschen, zum leichten Trocknen herausnehmen und mit neutralem Gummi versiegeln.
11. Bildaufnahme: Sammeln Sie Bilder durch mikroskopische Untersuchung und analysieren Sie sie mit der Halo-Software für die Panoramabildanalyse des Gewebes.
    HINWEIS: Hämatoxylin-gefärbte Zellkerne sind blau, und eine DAB-positive Expression wird als bräunlich-gelb beobachtet.

4. Nieren-IgA-Immunfluoreszenz

1. Bereiten Sie Paraffinschnitte für die Nieren vor, wie in Schritt 2.1 beschrieben.
2. Paraffinabschnitte entwachen:
   1. Legen Sie die Schnitte für 5 min in Xylol I, 5 min in Xylol II und 5 min in Xylol III. Die Abschnitte in wasserfreiem Ethanol I, wasserfreiem Ethanol II, 95 % Ethanol, 90 % Ethanol, 80 % Ethanol, 70 % Ethanol und 50 % Ethanol jeweils 5 Minuten lang behandeln und mit destilliertem Wasser waschen.
3. Proteinase K-Entnahme: Schütteln Sie die Schnitte trocken und ziehen Sie mit einem histochemischen Stift einen Kreis um den Gewebeschnitt. Geben Sie die Proteinase K-Arbeitslösung (1:9-Verhältnis aus Stammlösung und PBS) tropfenweise zu, um das Gewebe zu bedecken, und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei 37 °C. Waschen Sie die Abschnitte dreimal mit PBS für jeweils 5 Minuten.
4. Durchdringen der Zellmembran: Schütteln Sie die Abschnitte leicht trocken und bedecken Sie sie anschließend mit 0,1 % Triton. Inkubieren Sie 20 Minuten lang bei RT und waschen Sie die Abschnitte dreimal mit PBS für jeweils 5 Minuten.
5. Blockierung: Fügen Sie 10% Ziegenserum tropfenweise hinzu, um das Gewebe gleichmäßig zu bedecken, um es bei RT für 30 Minuten zu blockieren.
6. Inkubation des Primärantikörpers: Geben Sie eine angemessene Menge des Anti-Maus-Anti-Maus-IgA-Antikörpers (1:500) tropfenweise zu, um das Gewebe gleichmäßig zu bedecken, und inkubieren Sie es über Nacht bei 4 °C.
7. Färbekern: Waschen Sie die Scheiben dreimal mit PBS für jeweils 5 Minuten. Nach dem Entfernen des PBS den 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-Farbstoff tropfenweise auf die Schnitte geben und 15 min bei RT lichtgeschützt inkubieren.
8. Waschen und versiegeln Sie die Abschnitte: Waschen Sie die Abschnitte dreimal 5 Minuten lang mit PBS und versiegeln Sie sie dann mit einem lichtbeständigen Eindeckmedium.
9. Mikroskopie und Fotografie: Betrachten Sie die Schnitte unter dem Fluoreszenzmikroskop und machen Sie Bilder.
   HINWEIS: Bei DAPI beträgt die ultraviolette Anregung eine Wellenlänge von 330-380 nm und die Emissionswellenlänge von 420 nm für blaues Licht. Die Anregungswellenlänge von Fluoresceinisothiocyanat (FITC) beträgt 465-495 nm und die Emissionswellenlänge 515-555 nm, grünes Licht.

5. Zellkultur

1. Beziehen Sie die humane B-Lymphozytenlinie DAKIKI von ATCC, USA. Kultur von DAKIKI-Zellen in RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin.
2. Kultivieren Sie die Zellen in einem 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO₂ und subkultivieren Sie sie alle 2-3 Tage. Verwenden Sie für alle Experimente Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase.
3. Bei 70%-80% Konfluenz entnehmen Sie die Zellen mit einer sterilen Pipette und zentrifugieren Sie die Zellen bei 140 x g für 5 min. Den Überstand verwerfen, mit dem serumfreien Medium resuspendieren und nach 24 h alle Zellen für die nachfolgende Behandlung in einer Ruhephase belassen.

6. LDH-Zytotoxizitätsassays zum Screening sicherer DIO-Konzentrationen auf normalen DAKIKI-Zellen

1. SAKIKI-Zellen in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 4x10⁵ Zellen/Well aussäen und eine niedrige Kontrollgruppe, eine hohe Kontrollgruppe und unterschiedliche DIO-Konzentrationen (0,25, 0,5, 1,0, 2,0, 4,0, 8,0 μg/ml) einrichten. Nach entsprechender Behandlung nach der Gruppierungsmethode 24 h in einem Inkubator mit 5 % CO₂, 37 °C inkubieren.
2. Geben Sie gemäß den Anweisungen des Zytotoxizitätsnachweis-Kits 5 μl Lysat pro Vertiefung in die hohe Kontrollgruppe und legen Sie die Platte dann für 15 Minuten in einen 5 % CO_{2 -}, 37 °C-Inkubator.
3. Nehmen Sie die Platte heraus, geben Sie 100 μl des Reaktionsgemisches in jede Vertiefung, inkubieren Sie 10 Minuten lang im Dunkeln bei RT und fügen Sie dann 50 μl der Stoppreaktionslösung hinzu. Messen Sie den OD-Wert bei 490 nm so schnell wie möglich auf dem Mikroplatten-Reader.
4. Berechnen Sie die LDH-Freisetzungsrate verschiedener Konzentrationen von DIO und ≤10 % als maximale Dosis, die gemäß der Formel verabreicht wird: LDH-Freisetzungsrate = (experimentelle Vertiefung LDH - niedrige Kontroll-LDH) / (hohe Kontroll-LDH - niedrige Kontroll-LDH) x 100 %.

7. CCK-8-Assay zum Nachweis der Wirkung von DIO auf die Proliferation von DAKIKI-Zellen

1. Basierend auf den Ergebnissen unserer vorangegangenen Experimente²⁰ etablieren wir ein IgAN-Modell mit LPS 40 μg/ml zur Induktion von DAKIKI-Zellen.
2. Säen Sie dann 4x10⁵ Zellen/Well in 96-Well-Platten und teilen Sie sie in die Kontroll-, Modell- und DIO-Gruppen mit niedriger, mittlerer und hoher Konzentration (0,25 μg/ml, 0,5 μg/ml und 1,0 μg/ml) auf. Inkubieren Sie die Platten 24 h lang in einem Inkubator mit 5 % CO_{2 ,} 37 °C.
3. Geben Sie dann 20 μl CCK-8-Reagenz in jede Vertiefung und legen Sie die Platten für 2 Stunden zurück in den Inkubator (5 % CO₂, 37 °C). Weisen Sie nach der Inkubation den OD bei einer Wellenlänge von 450 nm so bald wie möglich auf dem Mikroplatten-Reader nach.

8. ELISA zum Nachweis der Wirkung von DIO auf die Sekretion von IgA und Gd-IgA1 durch DAKIKI-Zellen

1. DAKIKI-Zellen in 6-Well-Platten mit einer Dichte von 6x10⁶ Zellen/Well säen und die Zellen gemäß Schritt 7.2 gruppieren und behandeln. Die Zellen werden 24 h lang kultiviert, dann 10 min lang bei 4 °C bei 850 x g zentrifugiert, um den Überstand zu erhalten.
2. Ermitteln Sie die IgA- und Gd-IgA1-Konzentrationen gemäß den Anweisungen des Kits.

9.qRT-PCR zum Nachweis der Wirkung von DIO auf C1GALT1- und Cosmc-mRNA-Spiegel in DAKIKI-Zellen

1. Die DAKIKI-Zellen mit einer Dichte von 6x10⁶ Zellen/Well in eine 6-Well-Platte aussäen, die Zellen gruppieren und als CCK8 behandeln, wie in Schritt 7.2 erwähnt, und 24 Stunden inkubieren. Extrahieren Sie die Gesamt-RNA aus DAKIKI-Zellen gemäß den Anweisungen des Gesamt-RNA-Extraktionskits.
2. Nachdem Sie 1 μl extrahierte RNA aus jeder Probengruppe entnommen und deren Konzentration gemessen haben, transkribieren Sie umgekehrt 1 μg Gesamt-RNA aus jeder Probe in cDNA gemäß den Anweisungen des Kits.
3. Führen Sie dann eine RT-PCR-Amplifikation durch, um die Expression jedes Gens nachzuweisen (95 °C für 15 Minuten, 95 °C für 10 s und 60 °C für 30 s). Berechnen Sie das Expressionsniveau jedes Gens mit der ^{2-ΔΔCT-Methode mit β-Aktin} als interner Referenz.
   HINWEIS: Die Primersequenzen waren wie folgt:
   C1GALT1: 5'-AAGGTTGACACCCAGCCTAA-3', 5'-CTTTGACGTGTTTGGGGCCTTT-3';
   Cosmc: 5'-GCTCCTTTTTGAAGGGTGTG-3', 5'-TACTGCAGCCCAAAGACTCA-3';
   β-Aktin: 5'-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3', 5'-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3'.

10. Western Blotting zur Untersuchung der Wirkung von DIO auf die Expression von C1GALT1- und Cosmc-Proteinen in DAKIKI-Zellen

1. Aussaat der DAKIKI-Zellen mit einer Dichte von 6x10⁶ Zellen/Well in einer 6-Well-Platte. Gruppieren und behandeln Sie sie wie in Schritt 7.2 beschrieben. Nach 24 Stunden Inkubation sammeln Sie jede Zellgruppe.
2. Eine angemessene Menge Zelllyselösung (PMSF: Phosphatasehemmer: RIPA-Lyselösung = 1:1:100) zugeben und 30 min auf Eis inkubieren. Anschließend bei 13.500 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand auffangen.
3. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit dem BCA-Proteinkonzentrations-Assay-Kit.
4. Mischen Sie die Proteinproben mit 5x SDS-PAGE Ladepuffer im Verhältnis 4:1 durch Vortexen und erhitzen Sie die gemischten Proben 5 min lang bei 100 °C, um das Protein zu denaturieren.
5. Um Proteine mit unterschiedlichen Molekulargewichten nachzuweisen, geben Sie den Proteinmarker (5 μl/Well) und die Proben (20 μg/Well) in verschiedene Bahnen eines 12%igen SDS-PAGE-Gels, führen Sie die SDS-PAGE-Elektrophorese durch und übertragen Sie das Gel auf PVDF-Membranen.
6. Blockieren Sie die Membranen mit 5% fettfreier Milch für 2 h bei RT und inkubieren Sie mit den entsprechenden Primärantikörpern (C1GALT1 [1:1000], Cosmc [1:2000]) für 24 h. Verwenden Sie β-Aktin-Antikörper (1:100000) als interne Kontrolle.
7. Waschen Sie die Membran aus Polyvinylidenfluorid (PVDF) dreimal (10 min/Zeit) mit 1x Tris-gepufferter Kochsalzlösung, 0,1 % Tween 20 Reinigungsmittel (TBST) und inkubieren Sie dann mit dem entsprechenden sekundären Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (1: 10000) bei RT für 2 h.
8. Waschen Sie die Membran erneut mit TBST (dreimal für jeweils 10 Minuten) und behandeln Sie sie mit einer angemessenen Menge verbesserter Chemilumineszenz (ECL)-Arbeitslösung (gemäß den Anweisungen des Herstellers) für den Nachweis der Proteinbande.
9. Nehmen Sie die Bilder mit dem Chemilumineszenz-Bildgebungssystem auf und führen Sie eine semiquantitative Analyse der Grauwerte von Proteinen mit dem Bildanalysesystem Image J durch.

11. Anmelden Statistische Analyse

1. Verwenden Sie eine geeignete Softwareanwendung zur Analyse der Daten. Geben Sie alle Daten als Mittelwert ± SD (Standardabweichung) aus und werten Sie mehrere Stichproben durch einen Einweg-ANOVA-Test zum Vergleich zwischen den Gruppen aus.
   HINWEIS: Für die statistische Analyse wurde die SPSS-Statistiksoftware 26.0 verwendet. Die LSD-Methode wurde für bidirektionale Vergleiche zwischen Gruppen verwendet, wenn die Varianzen gleich waren, und die Dunnett T3-Methode wurde für bidirektionale Vergleiche zwischen Gruppen verwendet, wenn die Varianzen nicht gleich waren. P<0,05 wurde als Hinweis auf einen statistisch signifikanten Unterschied angesehen.

Diskussion

Charakteristisches pathologisches Merkmal von IgAN ist die Ablagerung von IgA1- und GD-IgA1-haltigen Immunkomplexen in der mesangialen Region des Glomerulus^21,22. Die Verringerung der Bildung von Immunkomplexen kann Nierenschäden reduzieren und die klinischen Symptome von IgAN lindern. In einem In-vivo-Experiment untersuchten wir die therapeutische Wirkung von DIO auf IgAN und fanden heraus, dass DIO die IgA-Ablagerung in der Niere von IgAN-Modellmäusen reduzieren kann. Es wird gezeigt, dass die Akkumulation von IgA-sezernierenden Zellen in der Niere mit der Pathogenese von IgAN²³ zusammenhängt. Als wichtiger Ort der Proliferation und Aktivierung von B-Lymphozyten ist das Peyer-Pflaster eine wichtige Quelle für IgA-sezernierende Zellen, daher untersuchten wir die Expression von B-Lymphozytenmarkern (CD20, CXCR5) in Peyer-Pflaster und fanden heraus, dass DIO die Expression von B-Lymphozyten im Peyer-Pflaster des IgAN-Mausmodells hemmen könnte. Diese experimentellen Ergebnisse könnten eine Grundlage für den Einsatz von DIO bei der Behandlung von IgAN bilden.

Wir haben die folgenden Experimente in vitro durchgeführt, um den Wirkmechanismus von DIO auf IgAN weiter zu untersuchen. Erstens wurde bereits gezeigt, dass DAKIKI, eine EBV-immortalisierte B-Zelllinie, die IgA1 sezerniert, zu dem auch GD-IgA1²⁴ gehört, ideal für die In-vitro-Erforschung des Wirkmechanismus des Medikaments auf IgAN ist. Wir haben uns für DAKIKI-Zellen entschieden, um den molekularen Mechanismus von DIO bei der Behandlung von IgAN zu untersuchen. Darüber hinaus spielt die schleimhauteigene entzündliche Immunantwort eine wesentliche Rolle bei der Pathogenese von IgAN. Wie oben erwähnt, verwenden wir LPS, um DAKIKI-Zellen zu stimulieren, die entzündungsfördernde Faktoren freisetzen und Entzündungsreaktionen vermitteln können, wodurch der Mechanismus der Immunantwort der Schleimhaut in IgAN besser nachgeahmt werden kann. Das in vitro zelluläre Modell könnte helfen, die Möglichkeiten und den Mechanismus anderer Medikamente zur Behandlung von IgAN zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten, dass DIO die Proliferation von DAKIKI-Zellen, die durch LPS stimuliert wurden, konzentrationsabhängig hemmte. DIO könnte die Sekretion von IgA und Gd-IgA1 in DAKIKI-Zellen durch LPS-Stimulation hemmen und die Expression von mRNA und Protein von C1GalT1 und seinem Chaperon Cosmc in DAKIKI-Zellen hochregulieren, was darauf hindeutet, dass DIO die Sekretion von Gd-IgA1 durch Hochregulierung der C1GALT1/Cosmc-Expression reduzieren und somit die übermäßige Aktivierung von DAKIKI-Zellen hemmen könnte.

Wichtige Schritte sollten während der experimentellen Verfahren notiert werden. Die Konzentration von Gd-IgA1 im DAKIKI-Zellüberstand liegt nicht innerhalb des Nachweisbereichs des ELISA-Kits (1,56 ~ 100 ng/ml), und der gesammelte Überstand muss durch ein Ultrafiltrationsröhrchen zentrifugiert werden, um das konzentrierte Gd-IgA1 zu erhalten. Stellen Sie außerdem sicher, dass das Volumen des Überstands ab jeder Gruppe gleich ist und das nach der Ultrafiltration erhaltene Endvolumen des Konzentrats gleich ist.

In dieser Studie haben wir sowohl in vitro als auch in vivo Methoden gleichzeitig eingesetzt, die sich gegenseitig in pharmakologischen Wirkungen unterstützen können und ein Beispiel für die Untersuchung der Wirkungen und ihrer Mechanismen der pflanzlichen Medizin darstellen. Einige Dinge könnten in diesem Protokoll verbessert werden. Erstens haben wir keine Blutkonzentrationen in der DIO-Sondengruppe der Mäuse nachgewiesen; Daher wird die DIO-Konzentration, die den Blutkonzentrationen entspricht, in vitro-Experimenten nicht verwendet. Zweitens wurde nur das DIO-Monomer, die aktive Komponente von DNR, untersucht; Die Auswirkungen anderer Komponenten von DNR auf IgAN müssen noch weiter untersucht werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie eine experimentelle Grundlage für die Behandlung von IgAN mit DIO, dem Wirkstoff von DNR, bietet. Diese Studie etablierte ein zelluläres pathologisches Modell von IgAN, indem sie die mukosale Immunantwort von IgAN sowohl in vitro als auch in vivo nachahmte. Es gibt eine neue Idee für das Studium der traditionellen chinesischen Medizin zur Vorbeugung und Behandlung von IgAN.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-CD20/MS4A1 Antibody	Boster Biotechnology Company	A03780-3
Antifade mounting medium	Beyotime, Shanghai, China	P0128S
Balb/c mice	Beijing Weitong Lihua Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	110322220101424000
blocking serum	Solarbio, Beijing, China	SL038
Bovine gamma globulin	ShangHai YuanYe Biotechnology Company	S12031
C1GALT1 polyclonal antibody	Proteintech Group, Inc,USA	27569-1-AP
Citrate antigen retrieval solution(50×)	Phygene Biotechnology Company	PH0422
COSMC polyclonal antibody	Proteintech Group, Inc,USA	19254-1-AP
Cytotoxiciy detection kit	Roche Company	4744926001
Dako REAL EnVision detection system, Peroxidase/DAB+	Dako	K5007
DAPI	Invitrogen	D1306
Dioscin	National Institute For Food and Drug Control	111707-201703
DIO tablets	Chengdu No 1 Pharmaceutical Co. Ltd.	H51023866
ECL working solution	Merck Biotechnology, Inc	WBKLS0100
Enhanced cell counting kit-8	Beyotime, Shanghai, China	C0043
Fasking one-step removal of gene cDNA first-strand synthesis premix	TIANGEN,Beijing, China	KR118-02
Glycogen Periodic acid Schiff (PAS) stain kit	BaSO Biotechnology Company	BA4080A
Goat anti-mouse IgA-AF488	SouthernBiotech	1040-30
Goat anti-rabbit IgG antibody (H+L), HRP conjugated	BeiJing Bioss Biotechnology Company	BS-0295G-HRP
Human Gd-IgA1 ELISA kit	IBL	27600
Human IgA ELISA kit	MultiSciences (LiankeBio)	70-EK174-96
Pierce BCA protein assay kit	Thermo Scientific	23227
PMSF solution	Beyotime, Shanghai, China	ST507
Proteinase K	Phygene Biotechnology Company	PH1521
Rabbit anti-CXCR5 polyclonal antibody	BeiJing Bioss Biotechnology Company	bs-23570R
RIPA lysis buffer	Beyotime, Shanghai, China	P0013B
RNAsimple total RNA extraction kit	TIANGEN,Beijing, China	DP419
RPMI Medium 1640	Solarbio, Beijing, China	31800
Super-Bradford protein assay kit	CWBIO, Beijing, China	CW0013
Triton X-100	Beyotime, Shanghai, China	ST795
β-Actin Rabbit mAb	Abclonal, Wuhan, China	AC026