Auswirkungen von Desmodium caudatum auf gastrointestinale Hormone und Darmflora bei Ratten mit Gastritis

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt das Verfahren zur Analyse der Darmflora unter Verwendung der Illumina-basierten 16S rRNA-Gensequenzierung und bietet einen Rahmen für die Bewertung der Wirksamkeit von Kräuterabkochungen.

Zusammenfassung

Um die Auswirkungen von Desmodium caudatum auf Gastritis und Darmflora bei Ratten vorläufig zu untersuchen, wurde ein chronisches Gastritis-Rattenmodell mit der klassischen Natriumsalicylat-Methode etabliert. Achtzehn SPF-Ratten wurden in drei Gruppen eingeteilt: die Kontrollgruppe (Gruppe C), die Modellgruppe (Gruppe M) und die Behandlungsgruppe (Gruppe T). Pathologische Abschnitte der Magenwand wurden Ratten in jeder Gruppe entnommen. Darüber hinaus wurden die Konzentrationen von Gastrin und Malondialdehyd im Serum von Ratten in jeder Gruppe mittels ELISA bestimmt. Darüber hinaus wurden die Auswirkungen von D. caudatum auf die Darmflora von Ratten mit Gastritis durch einen detaillierten Vergleich der Darmbakteriengemeinschaften in den drei Gruppen unter Verwendung der Illumina-basierten 16S rRNA-Gensequenzierung untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die Abkochung von D. caudatum den Malondialdehydgehalt reduzieren und den Gastringehalt erhöhen konnte. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die Abkochung von D. caudatum die Vielfalt und Fülle der Darmflora verbessert und einen positiven Einfluss auf die Behandlung von Gastritis ausübt, indem sie die Darmflora reguliert und wiederherstellt.

Einleitung

Die chronische Gastritis (CG), eine der häufigsten klinischen Erkrankungen, ist gekennzeichnet durch chronische und anhaltende entzündliche Veränderungen des Magenschleimhautepithels, das häufig und wiederholt von verschiedenen pathogenen Faktoren angegriffen wird¹. Die Inzidenzrate von CG steht an erster Stelle unter allen Arten von Magenerkrankungen und macht 40 % bis 60 % der ambulanten Versorgungsrate in der Klinik für Gastroenterologie^{aus 2}. Darüber hinaus steigt die Inzidenzrate im Allgemeinen mit dem Alter, insbesondere bei Personen mittleren Alters und älter³. Zweifellos verringert CG die Lebensqualität der Menschen erheblich und unterstreicht die dringende Notwendigkeit, neue Therapeutika zu entdecken.

Zahlreiche Studien haben berichtet, dass das Auftreten und die Entwicklung von CG mit der Sekretion von gastrointestinalen Hormonen wie Gastrin (GAS) ^{zusammenhängen4,5}. GAS, ein häufiges gastrointestinales Peptidhormon im Verdauungstrakt, stimuliert die Zellen zur Sekretion von Magensäure, indem es die Freisetzung von Histamin aus Eosinophilen fördert. Darüber hinaus verbessert es die Ernährung und Blutversorgung der Magenschleimhaut und fördert die Proliferation der Magenschleimhaut und der Scheitelzellen⁶. Daher kann Gastrin als Indikator zur Bewertung des Entwicklungsniveaus von CG verwendet werden. Darüber hinaus können Lipidperoxidationsprodukte, die durch reaktive Oxide ausgelöst werden, Entzündungszellen aktivieren, was zu CG führt. Malondialdehyd (MDA), ein Lipidperoxidationsmarker, ist ein häufig verwendeter Indikator zur Messung des Grades des oxidativen Stresses. Es spiegelt bis zu einem gewissen Grad den Gehalt an freien Radikalen in der Magenschleimhaut wider. Der MDA-Spiegel kann auf den Angriff von ungesättigten Fettsäuren in der lokalen Magenschleimhaut hinweisen, der durch freie Radikale verursacht wird ^7,8.

Die Darmmikroökologie besteht aus Millionen von Mikroorganismen, die sich im Darm des Wirts befinden und eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Gesundheit des Wirts und der Regulierung der Immunität des Wirts spielen. Eine gesunde Darmflora, die sich durch hohen Reichtum, Vielfalt und stabile Mikrobiota-Funktion auszeichnet, wirkt als Schutzbarriere gegen das Eindringen pathogener Mikroorganismen, indem sie am Stoffwechsel beteiligt ist. Störungen der Darmflora machen Menschen anfälliger für akute und chronische Magen-Darm-Erkrankungen ^9,10. In den letzten Jahren hat sich die Mikrobiota-Therapie bei Magen-Darm-Erkrankungen rasant weiterentwickelt und eine signifikante Wirksamkeit gezeigt¹¹. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Berücksichtigung der Darmflora entscheidend ist, um Magen-Darm-Erkrankungen zu verstehen und anzugehen.

Als unverzichtbarer Bestandteil des Schatzes der traditionellen chinesischen Medizin haben volksmedizinische Materialien eine große Bedeutung für die klinische Praxis und die Modernisierung der nationalen Medizin. Die Wurzeln und die ganzen Teile von Desmodium caudatum (Thunb.) DC. wird seit längerer Zeit häufig zur Linderung von Magenbeschwerden in der Gegend von Beichuan Qiang in der Stadt Mianyang eingesetzt. Einige Artikel weisen auf die wissenschaftliche Grundlage für die Behandlung von Magen-Darm-Erkrankungen mit D. caudatum hin und zitieren seine Wirkungen wie Hämostase, Antioxidation und Magen-Darm-Schutz 12,13,14. Aufgrund des Mangels an eingehender Forschung wurde jedoch kein klinischer pharmakodynamischer Mechanismus etabliert. Dieser Artikel zielt darauf ab, die Auswirkungen von D. caudatum bei der Behandlung von Gastritis auf der Grundlage von gastrointestinalen Hormonen und Darmflora zu untersuchen und eine Grundlage für seine rationale klinische Anwendung zu schaffen.

Protokoll

Die Verfahren für die Pflege und Verwendung von Tieren wurden von der Ethikkommission der Mianyang Normal University genehmigt, und alle relevanten institutionellen und behördlichen Vorschriften bezüglich der ethischen Verwendung von Tieren wurden strikt befolgt. Für die vorliegende Studie wurden SPF-Ratten (Kunming-Arten, sowohl männlich als auch weiblich, mit einem Gewicht von 180-220 g) verwendet. Die Tiere wurden aus einer kommerziellen Quelle bezogen (siehe Materialtabelle). Alle Tiere wurden in einer pathogenfreien Umgebung untergebracht und hatten ad libitum Zugang zu Nahrung.

1. Vorbereitung der Reagenzien

1. Bereiten Sie eine 5%ige Natriumsalicylatlösung vor, indem Sie 2,5 g Natriumsalicylatpulver (siehe Materialtabelle) mit einer elektronischen Waage abwiegen. Lösen Sie das Pulver in einer kleinen Menge destilliertem Wasser auf und verdünnen Sie es auf ein Gesamtvolumen von 50 ml.
2. Bereiten Sie den Sud von D. caudatum (12,8 g/kg) vor. 128 g D. caudatum (siehe Materialtabelle) werden gewogen, in einen Rundkolben mit 1000 ml destilliertem Laborwasser gegeben und auf ein Endvolumen von 100 ml konzentriert.

2. Gruppierung und Verwaltung

1. Teilen Sie die Ratten in verschiedene Gruppen ein und verabreichen Sie intragastrisch die erforderlichen Lösungen.
   HINWEIS: Für die vorliegende Studie wurden 18 Ratten (9 Männchen, 9 Weibchen) in drei Gruppen eingeteilt: die Kontrollgruppe (Gruppe C), die Modellgruppe (Gruppe M) und die Behandlungsgruppe (Gruppe T) mit 6 Ratten in jeder Gruppe. Die Kontrollgruppe erhielt Kochsalzlösung und die Modellgruppe erhielt 5 Wochen lang eine 5%ige Natriumsalicylatlösung in einer Dosis von 10 ml/kg/Tag¹⁵. Die Behandlungsgruppe wurde 5 Wochen lang mit einer 5%igen Natriumsalicylatlösung in einer Dosis von 10 ml/kg/Tag vorbehandelt, gefolgt von der Verabreichung des D. caudatum-Suds in einer Dosierung von 1 ml/100 g für 10 Tage^15,16.
2. Am letzten Tag des Versuchs wird der Kot der Ratten in trockenen und sterilen Mikrozentrifugenröhrchen mit der Schwanztragemethode¹⁷ gesammelt und in einem Ultratiefkühlschrank mit flüssigem Stickstoff eingefroren.
3. Nach dem Ende der Probenahme werden die Ratten durch Zervixluxation getötet (gemäß institutionell genehmigten Protokollen). Öffnen Sie die Bauchhöhle mit einer Schere, um die Bauchschlagader freizulegen.
   1. Führen Sie die Nadel (23-25 G) fast parallel in die Bauchaorta ein, sammeln Sie das Serum und bewahren Sie es in einem Ultratiefkühlschrank auf. Nehmen Sie die Mägen aus der Bauchhöhle¹⁶ und weichen Sie sie zur Konservierung in einer 10%igen Formalinlösung ein.
      HINWEIS: In Gruppe M wird das Modell der chronischen Gastritis als erfolgreich angesehen, wenn die Magenschleimhaut erweitert und verstopft ist und eine reguläre Drüsenmorphologie^{aufweist 15}, während eine geringe Menge an entzündlicher Zellinfiltration in der Lamina propria beobachtet wird.

3. Pathologischer Schnitt der Magenwand

1. Entnehmen Sie die Magenwandproben von Ratten in jeder Gruppe für pathologische Schnitte. Führen Sie anschließend eine routinemäßige Hämatoxylin-Eosin-Färbung durch, um die pathologischen Veränderungen zu beobachten und zu analysieren¹⁸.

4. Bestimmung der Magen-Darm-Hormone im Serum

1. Weisen Sie in der Serumprobe den Gehalt an Gastrin (GAS) und Malondialdehyd (MDA)¹⁹ mittels ELISA gemäß den Anweisungen des Herstellers nach (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie einen Mikroplatten-Reader für die Analyse.

5. Extraktion von fäkaler Gesamt-DNA und PCR-Amplifikation und -Aufreinigung

1. Führen Sie eine mikrobielle DNA-Extraktion mit dem handelsüblichen DNA-Isolierkit durch (siehe Materialtabelle) und bestimmen Sie die Konzentration und Reinheit mit dem UV-Vis-Spektralphotometer¹⁶. Beurteilen Sie anschließend die DNA-Integrität durch 1% Agarose-Gelelektrophorese¹⁸.
2. Amplifizieren Sie das 16S-rRNA-Gen des Bakteriums mit den Primern 338F (5′-ACT, CCT, ACG, GGA, GGC, AGC, AGC, AG-3′) und 806R (5′-GAC, TAC, HVG, GGG, GTW, TCT, AT-3′) unter Verwendung eines Thermocycler-PCR-Systems¹⁷. Die Primer werden aus kommerziellen Quellen bezogen (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Befolgen Sie das PCR-Programm: Denaturierung (3 min, 95 °C), gefolgt von 27 Zyklen (30 s, 95 °C; 30 s, 55 °C; 45 s, 72 °C) und einer abschließenden Verlängerung (10 min, 72 °C). Führen Sie PCR-Reaktionen mit den folgenden Komponenten durch: 4 μl 5× DNA-Polymerase-Puffer, 2 μl 2,5 mM dNTPs, 0,8 μl jedes Primers (5 μM), 0,4 μl DNA-Polymerase und 10 ng Template-DNA (siehe Materialtabelle).
3. Extraktion, Reinigung und Quantifizierung der PCR-Produkte sequentiell mit 2 % Agarosegel, handelsüblichem DNA-Gel-Extraktionskit bzw. Fluorometer¹⁷.

6. Sequenzierung

HINWEIS: Schritt 6 und Schritt 7 werden nach den zuvor veröffentlichten Methoden^20,21 durchgeführt.

1. Nutzen Sie die Illumina-Plattform für die Sequenzierung.
   HINWEIS: Ein Ende des DNA-Fragments ergänzt die Basis des in den Chip eingebetteten Steckers und befestigt ihn auf dem Chip. Das andere Ende ergänzt zufällig die Basis einer anderen angrenzenden unterirdischen Fuge und bildet eine "Brücke".
2. Führen Sie eine PCR-Amplifikation durch, um DNA-Cluster zu erzeugen. Linearisieren Sie DNA-Verstärker in Einzelstränge.
3. Einführung einer veränderten DNA-Polymerase neben Desoxyribonukleotidtriphosphaten (dNTPs) mit vier verschiedenen Fluoreszenzmarkern. Synthetisieren Sie nur eine Base pro Zyklus.
4. Verwenden Sie einen Laser, um die Oberfläche der Reaktionsplatte zu scannen und die Nukleotidtypen zu bestimmen, die während der Erstreaktion jeder Matrizensequenz polymerisiert werden.
5. Spalte die "Fluoreszenzgruppe" und die "Terminationsgruppe" chemisch, um das klebrige 3'-Ende wiederherzustellen. Fahren Sie anschließend mit der Polymerisation des zweiten Nukleotids fort.
6. Erhalten Sie die Sequenz der Template-DNA-Fragmente, indem Sie die in jeder Runde gesammelten Fluoreszenzsignalergebnisse analysieren.

7. Verarbeitung von Sequenzierungsdaten

1. Kürzen Sie zunächst die Lesevorgänge von Fastq-Rohdaten an jedem Standort mit einem Wert < Q20 und eliminieren Sie Lesevorgänge mit unsicheren Grundlagen. Erlauben Sie außerdem zwei Fehlanpassungen in genau aufeinander abgestimmten Zündhütchen. Führen Sie anschließend die Sequenzen mit einer Überlappung >10 bp zusammen.
2. Clustern Sie operative taxonomische Einheiten (OTUs) mit 97% Ähnlichkeit mit UPARSE und entfernen Sie chimäre Sequenzen mit UCHIME^20,21.
3. Verwenden Sie den RDP-Klassifikator-Algorithmus, um die Taxonomie jeder 16S-rRNA-Gensequenz anhand der Silva (SSU123) 16S-rRNA-Datenbank unter Verwendung einer Konfidenzschwelle von 70 % zu analysieren.
4. Führen Sie eine Alpha-Diversitätsanalyse und eine Beta-Diversitätsanalyse mit Mothur bzw. Qiime durch (siehe Materialtabelle).

8. Statistische Auswertung

1. Analysieren Sie die Daten in dieser Studie mit einer statistischen Analysesoftware (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie die Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) für Vergleiche zwischen mehreren Gruppen und verwenden Sie den LSD-Test (Least Significant-Difference) für Vergleiche zwischen zwei Gruppen.
2. Betrachten Sie P < 0,05 in allen Vergleichen als statistisch signifikant. P < 0,01 wird als äußerst signifikant angesehen.

Ergebnisse

Die Ergebnisse des pathologischen Abschnitts der Magenwand sind in Abbildung 1 dargestellt. Im Vergleich zu Gruppe C zeigte Gruppe M eine leichte Magenwandatrophie und eine leichte Entzündung. Im Vergleich zu Gruppe M zeigte Gruppe T jedoch keine offensichtliche Entzündung, Darmmetaplasie oder Atrophie. Dies deutet darauf hin, dass die Abkochung von D. caudatum die Gastritis wirksam verbessern kann.

Die Ergebnisse des gastrointestinalen Hormontests im S...

Diskussion

D. caudatum, eine häufig verwendete Volksmedizin der Qiang-Nationalität¹², hat eine signifikante Wirksamkeit bei der Behandlung von Magen-Darm-Erkrankungen gezeigt. Mit dem Fortschritt der modernen pharmakologischen Forschung wird das Ungleichgewicht der Flora, das sich aus dem Ungleichgewicht der gastrointestinalen Mikroökologie ergibt, als Schlüsselfaktor für akute und chronische Magen-Darm-Erkrankungen identifiziert^22,23. ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alpha diversity analysis	Mothur 1.30.2
AxyPrep deoxyribonucleic acid (DNA) gel extraction kit	Axygen Biosciences	AP-GX-50
Beta diversity analysis	Qiime 1.9.1
Cryogenic refrigerator	Forma-86C ULT freezer
Desmodium caudatum	The Traditional Chinese Medicine Hospital of Beichuan Qiang Autonomous County
E.Z.N.A. soil kit	Omega Bio-tek	D5625-01
Illumina MiSeq Platform	Illumina Miseq PE300/NovaSeq PE250
Multiskan Spectrum	spectraMax i3
OTU clustering	Uparse 7.0.1090
OTU statistics	Usearch 7.0
PCR instrument	TransGen AP221-02
PCR instrument	ABI GeneAmp 9700
QuantiFluor-ST double-stranded DNA (dsDNA) system	Promega Corp.
Sequence classification annotation	RDP Classifier 2.11
Sodium salicylate	Sichuan Xilong Chemical Co., Ltd	54-21-7
SPF rats	Chengdu Dashuo Experimental Animal Co., Ltd
SPSS 18.0	IBM