Mikrodissektion und Immunfluoreszenzfärbung von Myokardhülsen in murinen Pulmonalvenen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll demonstriert die mikroskopiegesteuerte Isolierung und Immunfluoreszenzfärbung von murinen Pulmonalvenen. Wir bereiten Gewebeproben vor, die den linken Vorhof, die Lungenvenen und die entsprechende Lunge enthalten, und färben sie für kardiales Troponin T und Connexin 43.

Zusammenfassung

Pulmonalvenen (PVs) sind die Hauptursache für ektopische Schläge bei Vorhofrhythmusstörungen und spielen eine entscheidende Rolle bei der Entstehung und dem Fortschreiten von Vorhofflimmern (VHF). PVs enthalten Myokardhülsen (MS), die aus Kardiomyozyten bestehen. MS ist an der Initiierung und Aufrechterhaltung von Vorhofflimmern beteiligt, da sie Ähnlichkeiten mit dem kardialen Arbeitsmyokard bewahrt, einschließlich der Fähigkeit, ektopische elektrische Impulse zu erzeugen. Nagetiere sind weit verbreitet und können hervorragende Tiermodelle für die Untersuchung des Lungenvenenmyokards darstellen, da Kardiomyozyten überall in der Gefäßwand vorhanden sind. Die präzise Mikrodissektion und Präparation von murinen PVs ist jedoch aufgrund der geringen Organgröße und der komplizierten Anatomie eine Herausforderung.

Wir demonstrieren ein mikroskopiegesteuertes Mikrodissektionsprotokoll zur Isolierung des murinen linken Vorhofs (LA) zusammen mit den PVs. Eine Immunfluoreszenzfärbung mit kardialen Troponin-T (cTNT) und Connexin 43 (Cx43) Antikörpern wird durchgeführt, um die LA und PVs in voller Länge sichtbar zu machen. Die Bildgebung mit 10-facher und 40-facher Vergrößerung bietet einen umfassenden Blick auf die PV-Struktur sowie detaillierte Einblicke in die myokardiale Architektur, wobei insbesondere das Vorhandensein von connexin 43 im MS hervorgehoben wird.

Einleitung

Vorhofflimmern ist die häufigste anhaltende Herzrhythmusstörung¹. Die Prävalenz von Vorhofflimmern nimmt mit einer erwarteten Zahl von ~17,9 Millionen Patienten in Europa im Jahr 2060 noch weiter zu¹. Vorhofflimmern ist klinisch von großer Bedeutung, da es ein wesentlicher Risikofaktor für die Entwicklung von Myokardinfarkt, Herzinsuffizienz oder Schlaganfall ist, was zu einer enormen individuellen, sozialen und sozioökonomischen Belastung führt¹. Obwohl Vorhofflimmern seit Jahrzehnten bekannt ist, ist die Pathophysiologie von Vorhofflimmern immer noch nicht vollständig verstanden².

Bereits in den späten 1990er Jahren zeigten Studien den großen Einfluss von Pulmonalvenen (PVs) auf die Initiierung und Aufrechterhaltung von Vorhofflimmern, da sie die Hauptquelle für Vorhofflimmern auslösende ektopische Schläge sind³. Es konnte gezeigt werden, dass sich PVs strukturell von anderen Blutgefäßen unterscheiden. Während typische Blutgefäße glatte Muskelzellen enthalten, enthält die Tunica media von PVs auch Kardiomyozyten⁴. Bei Nagetieren ist diese Herzmuskulatur ubiquitär in den gesamten PVs, einschließlich der intra- und extrapulmonalen Anteile, sowie der Öffnungsregion⁵ vorhanden. Beim Menschen enthalten PVs auch Kardiomyozyten, die innerhalb von Ausläufern des linken Vorhofmyokards (LA) beobachtet werden können - sogenannte Myokardhülsen (MS)^6,7.

MS weisen morphologische Ähnlichkeiten mit dem Vorhofmyokard⁸ auf. Die Form und Größe von Vorhof- und PV-Kardiomyozyten unterscheidet sich nicht signifikant untereinander und zeigt vergleichbare elektrophysiologische Eigenschaften⁸. Elektrophysiologische Aufzeichnungen innerhalb des PV haben die elektrische Aktivität der MS nachgewiesen, und angiographische Bildgebung hat Kontraktionen gezeigt, die mit dem Herzschlag synchronisiert^{sind 9,10}.

Gap Junctions sind porenbildende Proteinkomplexe, die aus sechs Connexin-Untereinheiten bestehen und den Durchgang von Ionen und kleinen Molekülen ermöglichen¹¹. In den Zell-zu-Zell-Appositionen existieren Gap Junctions, die benachbarte Kardiomyozyten miteinander verbinden und eine interzelluläre elektrische Kopplung zwischen Kardiomyozyten^{ermöglichen 12,13}. Im Herzen werden mehrere Connexin-Isoformen exprimiert, wobei Connexin 43 (Cx43) die häufigste Isoform ist, die in allen Regionen des Herzens exprimiert^{wird 14}. Frühere Studien liefern Hinweise auf die Expression von Cx43 in Kardiomyozyten der PVs^15,16.

Die Untersuchung von MS in intakten PVs ist aufgrund ihrer empfindlichen Struktur, insbesondere in Kleintiermodellen, nach wie vor eine Herausforderung. In dieser Arbeit zeigen wir, wie PVs zusammen mit LA und Lungenlappen in Mäusen mittels mikroskopiegesteuerter Mikrodissektion identifiziert und isoliert werden können. Darüber hinaus demonstrieren wir die Immunfluoreszenzfärbung (IF) von PVs, um Kardiomyozyten und ihre Verbindungen innerhalb der PVs sichtbar zu machen.

Protokoll

Die Tierpflege und alle Versuchsabläufe wurden nach den Richtlinien der Tierpflege- und Ethikkommission der Ludwig-Maximilians-Universität München durchgeführt und alle Verfahren mit Mäusen wurden von der Regierung von Oberbayern genehmigt (ROB 55.2-2532. Vet_02-20-215, ROB 55.2-2532. Vet_02-18-46, ROB 55.2-2532. Vet_02-19-86, ROB 55.2-2532. Vet_02-21-178, ROB 55.2-2532. Vet_02-22-170). C57BL6/N-Mäuse wurden kommerziell gewonnen.

1. Vorbereitung

1. Bereiten Sie ein 3%iges Agarose-Gel vor, indem Sie 3 mg Agarose und 100 ml 1x Tris-gepufferte Kochsalzlösung in einem 500-ml-Erlenmeyerkolben mischen. Erhitzen Sie die Lösung in einer Mikrowelle bei 600 W für 2-3 Minuten, bis das Gel homogen wird.
2. Bereiten Sie die Sezierschale vor, indem Sie das Gel vorsichtig in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 100 mm gießen. Füllen Sie die Petrischale zur Hälfte mit Gel. Entfernen Sie Blasen aus dem Gel, um eine homogene Konsistenz zu gewährleisten. Lassen Sie die Sezierschale abkühlen, bis das Gel fest wird.
3. Bereiten Sie alle benötigten Puffer und Lösungen vor, einschließlich Fixierlösung, Permeabilisierungslösung, Sperrpuffer und Waschpuffer gemäß den in Tabelle 1 angegebenen Rezepten.

2. Organentnahme und Gewebeaufbereitung

ANMERKUNG: Ein ausführliches Protokoll, das das Verfahren der Mausanästhesie und der Entnahme des Herzens detailliert beschreibt, wurde bereits veröffentlicht^17,18. Daher präsentieren wir nur eine kurze Beschreibung dieses Teils. Die Experimente wurden an 12 bis 16 Wochen alten C57BL6-Mäusen (sechs Männchen, vier Weibchen) durchgeführt. Das Körpergewicht des Männchens erstreckte sich von 26 g auf 28 g und das des Weibchens von 19 g auf 22 g. Die folgenden Schritte wurden ohne vorherige systemische Heparin-Injektion durchgeführt.

1. Betäuben Sie die Maus mit Isofluran (5%, 95% Sauerstoff, Durchfluss: 1 L/min) und sorgen Sie für eine ausreichende Narkosetiefe.
2. Bewegen Sie die Maus auf den Operationstisch und positionieren Sie sie in Rückenlage. Halten Sie die Narkose mit Isofluran-Inhalation (2%, 98% Sauerstoff, Durchfluss: 1 L/min) durch eine Anästhesiemaske aufrecht und fixieren Sie die Maus mit Klebeband an ihren Extremitäten. Fentanyl zur Analgesie injizieren (0,1 mg/25 g Körpergewicht i.p.).
3. Heben Sie das Fell am Processus xiphoidales an und setzen Sie einen Querschnitt von 2 mm. Trennen Sie das Fell von der Unterhautfaszie durch stumpfe Dissektion (Rückseite der Schere) und verlängern Sie den Schnitt kranial und seitlich, um den Thorax freizulegen.
4. Öffnen Sie vorsichtig den Bauch kaudal bis zum Rippenbogen. Heben Sie den Processus xiphoidales leicht an, um das Zwerchfell vom Schwanz zu schneiden und die Lunge kollabieren zu lassen. Schneiden Sie dann das Zwerchfell von links nach rechts, ohne Organe zu verletzen, und öffnen Sie den Thorax beidseitig, um das Herz freizulegen.
5. Durchtrennen Sie die untere Hohlvene (IVC), während das Herz noch schlägt, um die Maus zu exsanguinieren, und fahren Sie mit der Durchblutung des Herzens fort, indem Sie mit einer 27-G-Nadel in die linke Herzkammer eindringen und 10 ml eiskalte 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) injizieren.
6. Nachdem Sie das Blut aus dem Mäuseherzen entfernt haben, lokalisieren Sie den Aortenbogen, die obere Hohlvene (SVC) und die Luftröhre. Schneiden Sie sie ~3 mm oberhalb der Herzbasis ab und ernten Sie das Herz zusammen mit den angeschlossenen Lungen.
7. Tauchen Sie die entnommenen Organe in ein konisches 10-ml-Röhrchen, das 2 ml sterilisierte 30%ige Saccharoselösung enthält. Lassen Sie die Proben 24 Stunden lang bei 4 °C dehydrieren.

3. Mikroskopische Präparation von LA und PVs

1. Legen Sie das dehydrierte Herz und die Lunge in eine Sezierschale mit 40-50 ml 1x PBS. Halten Sie es unter ein Hellfeldmikroskop mit 10-facher Vergrößerung und richten Sie die Beleuchtung ein. Legen Sie das Herz mit seiner dorsalen Oberfläche auf die Sezierschale. Identifizieren Sie den Übergang zwischen Ventrikel- und Vorhofwand und trennen Sie die Ventrikel vorsichtig mit einer chirurgischen Schere von den Vorhöfen.
   HINWEIS: Schneiden Sie ca. 1 mm unterhalb der Vorhöfe, um etwas ventrikuläres Gewebe zu erhalten. Dies wird später benötigt, um die Vorhöfe an der Sezierschale zu befestigen, ohne die Strukturen an der Herzbasis zu beschädigen. Wir empfehlen, die Ventrikel zu behalten, da sie als positive Kontrollprobe verwendet werden können. Um das ventrikuläre Gewebe einzubetten, befolgen Sie das gleiche Verfahren, das für die Einbettung der PVs beschrieben ist, wie in Abschnitt 4 beschrieben.
2. Legen Sie die abgetrennten Vorhöfe mit der ventrikulären Schnittfläche (Schritt 3.1) so auf die Sezierschale, dass die Herzbasis nach oben zeigt. Richten Sie die Vorhöfe so aus, dass sich die Lungenlappen nach hinten befinden, das LA und das linke Vorhofohr (LAA) auf der rechten Seite und der rechte Vorhof (RA) und das rechte Vorhofohr (RAA) auf der linken Seite. Fixieren Sie das Präparat, indem Sie das verbleibende linksventrikuläre Gewebe in die Sezierschale stecken. Spreizen Sie die Lungenlappen vorsichtig und ohne übermäßige Kraftanwendung und stecken Sie sie an der Sezierschale fest (Abbildung 1A).
3. Verschaffen Sie sich einen Überblick über die anatomischen Landmarken an der Herzbasis.
   1. Finde die Aorta mit dem Aortenbogen in der Mitte der Herzbasis.
   2. Erkennen Sie den Truncus pulmonalis (PT) direkt rechts von der Aorta und folgen Sie seinem Verlauf in Richtung posterior, um die Lungenarterien (PAs) zu unterscheiden. Überprüfen Sie ihre Position, indem Sie ihrem Verlauf bis zum linken und rechten Ober-/Mittellappen folgen, um das entsprechende Lungenhilum (LH) zu finden.
   3. Bestimmen Sie die Position der Luftröhre und/oder der linken und rechten Hauptbronchien (L Br, R Br), die sich hinter der Aorta befinden, und überprüfen Sie ihre Lage, indem Sie ihren Verlauf in Richtung LH verfolgen (Abbildung 1A).
   4. Suchen Sie den SVC links von der Aorta und überprüfen Sie ihn, indem Sie seinem Verlauf in die RA neben der RAA folgen.
4. Entfernen Sie Binde- und Fettgewebe um die Herzbasis herum und bewahren Sie dabei alle oben genannten identifizierten Landmarken. Entfernen Sie zusätzlich den Aortenbogen und die Luftröhre, um freie Sicht auf die Herzbasis zu haben (Abbildung 1B).
5. Trennen Sie die PAs vorsichtig von der oberen Oberfläche des Atriums, indem Sie sie stumpf mit einer feinen Pinzette präzieren. Schneiden Sie sie anschließend bei LH ab und drehen Sie sie zur Seite, um die linke atriale freie Wand (LAFW) und die PVs in ihrer vollen Dimension freizulegen. Schneiden Sie die Hauptbronchien vom LH ab und entfernen Sie das Bronchialgewebe (Abbildung 1C).
   HINWEIS: Der LH dient sowohl als gemeinsamer Eintrittspunkt für PAs und Atemwege in die Lunge als auch als Austrittspunkt für die PVs. Es ist wichtig, jeden Eingriff am LH sorgfältig durchzuführen, um Schäden an den PVs zu vermeiden.
6. Um die LA/RA und den linken und rechten Ventrikel (LV, RV) zu trennen, wird ein Schnitt vom vorderen Teil des verbleibenden RV nach oben durch die Trikuspidalklappe (TV) bis zur vorderen Seite des SVC durchgeführt, um die RA von der Stirnseite zu öffnen. Durchtrennen Sie die posteriore RA-freie Wand (RAFW) neben dem Vorhofseptum, um RA und LA zu trennen. Durchtrennen Sie die hintere rechte Ventrikelwand neben dem interventrikulären Septum, um LV und RV vollständig zu durchtrennen.
   ANMERKUNG: Ein ausführliches Protokoll, in dem das Verfahren der Präparation und Isolierung des rechten Vorhofs detailliert beschrieben wird, wurde bereits veröffentlicht¹⁹. Die Abtrennung der RA ist nützlich, um unerwünschtes Gewebe aus dem LA-PV-Gewebekomplex zu entfernen und Gewebe für weitere Experimente zu sammeln.
7. Reduzieren Sie die Größe der Lungenlappen, indem Sie einen Teil des basalen Lungengewebes abschneiden, so dass etwa 3-4 mm Lungengewebe übrig bleiben.
   HINWEIS: Bewahren Sie die Spitzen der Lungenlappen, da sie während der nachfolgenden Einbettungsschritte als Schwimmer dienen, und ermöglichen Sie die horizontale Einbettung der PVs in die O.C.T.-Verbindung.

4. Einbettung von Gewebe

1. Übertragen Sie das Präparat, einschließlich LA und PVs, in eine Kryoform und stellen Sie sicher, dass die Herzbasis und die Lungenspitze nach oben zeigen. Ordnen Sie sie in einer physiologischen Konfiguration an und stellen Sie sicher, dass die PVs nicht verdreht oder umgedreht werden.
2. Füllen Sie das Kryomom mit O.C.T.-Compound und komprimieren Sie die PVs vorsichtig mit einer feinen Pinzette, um die restliche Luft zu entfernen. Behalten Sie ihre physiologische Konfiguration während des gesamten Prozesses unverändert bei.
3. Legen Sie das Kryomom mit dem eingebetteten Gewebe auf Trockeneis, um die O.C.T.-Verbindung einzufrieren. Lagern Sie die Proben für die spätere Verwendung bei -80 °C.
   HINWEIS: Es ist wichtig, die PVs in einer horizontalen Position zu halten, um sicherzustellen, dass Abschnitte mit PVs in voller Länge für nachfolgende Verfahren erhalten werden.

5. Schneiden und Entnehmen von gefrorenen Gewebeschnitten

HINWEIS: Zum Schneiden der Gewebeblöcke wurden die Maschineneinstellungen auf eine Probentemperatur von -18 °C und eine Klingentemperatur von -25 °C eingestellt.

1. Installieren Sie einen Gewebeblock auf dem Probenhalter, indem Sie eine Schicht O.C.T.-Compound zwischen dem Gewebeblock und dem Probenhalter auftragen. Für 3-4 Minuten einfrieren.
2. Blockieren Sie den Probenkopf und laden Sie den Probenhalter mit dem Gewebeblock auf den Probenkopf, indem Sie den Hebel für die Probenaufnahmevorrichtung schließen. Stellen Sie die Position des Gewebeblocks mit den Feineinstellknöpfen fein ein.
3. Entfernen Sie das Kryomom von der Probe. Entsperren Sie den Probenkopf und die elektrische Bremse des Kryostaten.
4. Stellen Sie den Kryostaten in den Trimmmodus mit einer Trimmgröße zwischen 30 μm und 50 μm. Trimmen Sie die Gewebeprobe, bis die PVs sichtbar werden.
5. Wechseln Sie in den Feinschliff-Modus und stellen Sie die Dicke auf 10 μm ein. Beginnen Sie mit der Entnahme von Schnitten, einschließlich PVs und angeschlossenem Lungen- und Vorhofgewebe. Sammeln Sie die Abschnitte mit einer Anti-Roll-Platte oder indem Sie das freie Ende jedes Abschnitts mit einer feinen kalten Bürste am Messerhalter fixieren und verteilen.
6. Positionieren Sie einen Objektträger (bei Raumtemperatur) neben dem Abschnitt. Lösen Sie den Abschnitt vorsichtig von der Bürste und lassen Sie den Abschnitt auf natürliche Weise am Objektträger haften, da der gefrorene Abschnitt und die O.C.T.-Verbindung beim Berühren der wärmeren Objektträgeroberfläche schmelzen.
   HINWEIS: Achten Sie während des Abschnitts auf einen stabilen und schonenden Zustand, um Brüche oder Falten in den Abschnitten zu vermeiden. Ersetzen Sie die Klinge bei Bedarf durch eine neue Klinge.
7. Sammeln Sie bis zu drei Abschnitte auf jeder Folie. Beschriften Sie die Objektträger und lagern Sie sie bei -20 °C.
   HINWEIS: Wir empfehlen, für jeden PV mindestens fünf Abschnitte (entspricht zwei Objektträgern) zu sammeln.

6. Immunfluoreszenzfärbung von Kryoschnitten aus den PVs

1. Legen Sie die gefrorenen Objektträger auf ein Färbesystem und lassen Sie die Schnitte ca. 20 Minuten bei Raumtemperatur auftauen.
   HINWEIS: Füllen Sie das Färbesystem mit Wasser, um die Proben befeuchtet zu halten. Das Austrocknen des Gewebes kann Antigene schädigen, was zu unspezifischen Antikörperbindungen und Überfärbungsartefakten während der Färbeverfahren führt.
2. Nach 20 Minuten Auftauen bedecken Sie die Abschnitte mit einigen Tropfen Fixierlösung (4% Paraformaldehyd [PFA], Tabelle 1), um das Gewebe auf den Objektträgern für 10 Minuten bei Raumtemperatur zu fixieren.
3. Nach der Fixierung überführen Sie die Objektträger in das vertikale Objektträgergestell und tauchen Sie sie in einen Behälter, der mit 1x PBS gefüllt ist. Stellen Sie den Behälter bei niedriger Geschwindigkeit auf einen Shaker und waschen Sie die Objektträger 5 Minuten lang. Wiederholen Sie diesen Waschgang noch zwei weitere Male und verwenden Sie jedes Mal frisches 1x PBS.
4. Nach dem Waschen jeden einzelnen Abschnitt auf jedem Objektträger mit einem xylolhaltigen Flüssigblocker-Stift einkreisen. Ordnen Sie die Objektträger auf dem Färbesystem neu an und tragen Sie mit einer Pasteurpipette 1 oder 2 Tropfen Permeabilisationslösung (0,1 % Triton X-100, Tabelle 1) auf jede Probe auf. Lassen Sie die Abschnitte 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren, um die Zelle und die Zellorganellenmembranen zu permeabilisieren.
5. Entfernen Sie nach der Permeabilisierung die 0,1%ige Triton X-100-Lösung, indem Sie die Objektträger 3 x 5 Minuten lang in 1x PBS waschen, wobei Sie das gleiche Verfahren wie in Schritt 6.3 beschrieben befolgen.
6. Ordnen Sie die Objektträger nach dem Waschen auf dem Färbesystem neu an und tragen Sie 1 oder 2 Tropfen des Blockierungspuffers (Tabelle 1) auf jeden Abschnitt auf, wobei Sie sicherstellen müssen, dass sie vollständig mit dem Blockierungspuffer bedeckt sind. Lassen Sie die Objektträger 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.
7. Bereiten Sie 1 ml der primären Antikörpermischung vor, indem Sie 5 μl eines Maus-Anti-cTNT-Antikörpers (verdünnt 1:200) und 1 μl eines Kaninchen-Anti-Cx43-Antikörpers (verdünnt 1:1.000) in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren, das mit 994 μl Blocking-Puffer gefüllt ist. Pipettieren Sie die Mischung auf und ab, um eine gründliche Durchmischung zu gewährleisten.
   HINWEIS: Passen Sie die Menge der aufgetragenen Antikörpermischung entsprechend der Größe des Abschnitts an. Stellen Sie sicher, dass die Abschnitte vollständig von der Antikörpermischung bedeckt sind. Die Konzentration, die Inkubationszeit und die optimale Inkubationstemperatur von Antikörpern können je nach Faktoren wie Antikörpertyp, Antikörperklonen und Gewebeeigenschaften variieren. Wir empfehlen, die Färbebedingungen für jeden Antikörper einzeln zu testen und zu optimieren.
8. Nach dem Blockierungsschritt (Schritt 6.6) entfernen Sie den verbleibenden Blockierungspuffer und tragen Sie direkt 2 oder 3 Tropfen der primären Antikörpermischung auf jeden Abschnitt auf. Lassen Sie die Objektträger über Nacht bei 4 °C inkubieren.
9. Nach der Inkubation der primären Antikörper werden die Objektträger 3 x 5 Minuten lang mit Waschpuffer unter leichtem Schütteln gewaschen (Tabelle 1).
10. Bereiten Sie 1 ml der sekundären Antikörpermischung vor, indem Sie 1 μl eines AF488-konjugierten Ziegenantimaus-Sekundärantikörpers (1:1.000 verdünnt) und 1 μl eines AF568-konjugierten Ziegen-Antikaninchen-Sekundärantikörpers (1:1.000 verdünnt) in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren, das mit 998 μl Waschpuffer gefüllt ist. Pipettieren Sie die Mischung nach oben und unten, um sie gut zu vermischen.
11. Nach dem Waschschritt (Schritt 6.9) werden die Objektträger im Färbesystem neu angeordnet und 2 oder 3 Tropfen der Sekundärantikörpermischung mit einer Pipette auf jeden Abschnitt aufgetragen. Lassen Sie die Antikörper 45 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren, während Sie die Proben vor Licht schützen, um eine Fluorophorlöschung zu verhindern. Nach der sekundären Antikörper-Inkubation werden die Objektträger 3 x 5 min mit Waschpuffer unter leichtem Schütteln gewaschen (Tabelle 1).
12. Ordnen Sie die Objektträger auf dem Färbesystem neu an. Die Abschnitte werden mit Hoechst-33342 (in einer Verdünnung von 1:1.000 in 1x PBS) gegengefärbt, indem Sie 2 bis 3 Tropfen der Hoechst-33342-Lösung auf jeden Abschnitt auftragen. Lassen Sie die Objektträger 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
13. Nach der Inkubation waschen Sie die Objektträger 3 x 5 min mit Washing Buffer unter leichtem Schütteln (Tabelle 1). Montieren Sie die Objektträger, indem Sie 1 oder 2 Tropfen fluoreszierendes Eindeckmedium auf jeden Objektträger auftragen. Decken Sie die Objektträger mit Deckgläsern ab.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Deckglas flach ist, wenn Sie es auflegen. Wenn Luftblasen vorhanden sind, üben Sie vorsichtig Druck auf die Seite der Blase aus, um sie zu entfernen.
14. Lagern Sie die montierten Objektträger in einem Objektträger bei 4 °C.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, die Folien so früh wie möglich abzubilden. Dieses Protokoll gilt nicht ausschließlich für die genannten Antikörper. Zielantigene und Antikörper können entsprechend den individuellen Anforderungen des Experiments oder alternativen Antigennachweisstrategien ausgetauscht oder modifiziert werden.

7. Bildgebung der Immunfluoreszenz-Färbeschichten

1. Richten Sie das Mikroskop ein.
   1. Starten Sie das Mikroskop mit der Laserlichtquelle, dem angeschlossenen Computer und der zugehörigen Software gemäß der Bedienungsanleitung des Herstellers.
   2. Rufen Sie das Konfigurationsmenü auf. Klicken Sie hier, um den geeigneten Kameratyp für die Fluoreszenzbildgebung auszuwählen (z. B. DFC365FX Monochromkamera).
   3. Rufen Sie das Menü "Erfassen" auf und erstellen Sie drei Kanäle.
   4. Wählen Sie den Kanal FCr1 für die Detektion von Hoechst-33342 aus, beschriften Sie ihn und wählen Sie im Auswahlbereich den DAP-Filterwürfel aus. Stellen Sie die Belichtungszeit auf 200 ms, die elektronische Verstärkung auf 2 und die Lichtintensität auf 17 % ein.
   5. Wählen Sie den Kanal FCr2 für den Nachweis von cTNT (gefärbt mit AF488-konjugierten Antikörpern), markieren Sie ihn und wählen Sie den L5-Filterwürfel im Auswahlbereich aus. Stellen Sie die Belichtungszeit auf 200-300 ms, die elektronische Verstärkung auf 1,8 und die Lichtintensität auf 100% ein.
   6. Wählen Sie den Kanal FCr3 für den Nachweis von Cx43 (gefärbt mit AF568-konjugiertem Antikörper), markieren Sie ihn und wählen Sie den TXR-Filterwürfel im Auswahlbereich aus. Stellen Sie die Belichtungszeit auf 150 ms, die elektronische Verstärkung auf 2 und die Lichtintensität auf 100 % ein.
      HINWEIS: Die spektralen Eigenschaften der Filterwürfel sind in Tabelle 2 aufgeführt.
2. Legen Sie den Objektträger auf den Mikroskoptisch.
3. Führen Sie eine Übersichtsaufnahme mit 10-facher Vergrößerung durch:
   1. Wählen Sie das 10x-Objektiv aus und öffnen Sie den Laserverschluss, indem Sie auf Live klicken. Wenn der FCr1-Kanal ausgewählt ist, navigieren Sie mit der Navigator-Funktion durch die Folie, bis ein Signal erkannt wird. Fokussieren Sie die Probe grob, bis die Zellkerne unterscheidbar sind.
   2. Starten Sie den Spiralscan-Modus , um eine vollständige Vorschau der Probe zu erfassen. Deaktivieren Sie live , indem Sie erneut auf die Schaltfläche klicken, um die Probe zu schützen. Identifizieren Sie das LA, die PVs und das Lungengewebe.
   3. Definieren Sie den Interessenbereich für den nachfolgenden Kachelscan. Wählen Sie mehrere Fokuspunkte innerhalb des Interessenbereichs aus. Klicken Sie im FCr1-Kanal auf Live und passen Sie den Fokus für jedes Fokusmessfeld an. Speichern Sie die entsprechenden Z-Positionen, die die genaue Fokusposition für jedes Fokusmessfeld darstellen. Starten Sie den Kachelscan mit 10-facher Vergrößerung, um ein vollständiges Übersichtsbild der Probe zu erfassen.
   4. Nachdem der Scan abgeschlossen ist, öffnen Sie den Kachelscan und fügen Sie die einzelnen Bilder zusammen. Um die Helligkeit und den Kontrast einzelner Kanäle zu erhöhen, wählen Sie diese in der Objektleiste aus und passen Sie ihren Signalbereich mit den Schiebereglern wie gewünscht an.
4. Erhalten Sie vergrößerte Bilder mit 40-facher Vergrößerung:
   1. Wählen Sie das 40-fache Objektiv aus. Stellen Sie die Belichtungszeit und die Verstärkungseinstellungen für jeden Kanal wie folgt ein: FCr1: DAP-Filterwürfel: Belichtungszeit: 50 ms, Verstärkung: 1,5; FCr2: L5-Filterwürfel: Belichtungszeit: 80 ms, Verstärkung: 1,8; FCr3: TXR-Filterwürfel: Belichtungszeit: 20 ms, Verstärkung: 2.
   2. Verwenden Sie das Übersichtsbild von Schritt 7.3, um die PV-Öffnung (PVO) sowie extrapulmonale und intrapulmonale PV-Bereiche (PV_ex, PV_in) zu lokalisieren. Definieren Sie diesen Bereich, der gescannt werden soll.
   3. Öffnen Sie das Untermenü Bild und klicken Sie auf z , um den Z-Stapel zu aktivieren.
      1. Wählen Sie den FCr1-Kanal aus und öffnen Sie den Laserverschluss, um eine Live-Vorschau zu erhalten.
      2. Gehen Sie zum Untermenü Z-Stack und bestimmen Sie den Start - und Endpunkt des Z-Stacks, indem Sie denfocus-Feineinstellknopf im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn drehen, bis das Gesamtsignal den Fokus verliert.
      3. Nachdem Sie den Fokusbereich eingerichtet haben, wählen Sie den Modus Systemoptimierter Z-Stapel und aktivieren Sie die Option Erweiterte Schärfentiefebilder (EDF) berechnen. Je nachdem, wie flach das Gewebe ist, ist mit ca. 20 Schichten mit einem Schrittabstand von ca. 0,5 μm zu rechnen.
   4. Beginnen Sie mit dem Kachelscan. Öffnen Sie nach dem Scannen den Kachelscan und fügen Sie nur das EDF-Bild zusammen. Um die Helligkeit und den Kontrast einzelner Kanäle zu erhöhen, wählen Sie diese in der Objektleiste aus und passen Sie ihren Signalbereich mit den Schiebereglern wie gewünscht an (siehe Schritt 7.3.4).
5. Nachdem Sie die Bilder generiert haben, speichern Sie das Projekt und exportieren Sie sowohl die zusammengeführte Version als auch die RAW-Kanäle jedes Bildes als TIFF-Datei.
   HINWEIS: Wenn Sie die Dateien als ImageJ-lesbares TIFF speichern, kann ImageJ die ursprüngliche Kachelgröße in μm anstelle von Pixeln importieren. Schließen Sie den Laserverschluss immer dann, wenn kein Lasersignal benötigt wird, um ein Photobleichen der Sekundärantikörper zu verhindern.

8. Bildbearbeitung mit ImageJ

1. Laden Sie die entsprechenden Raw-Kanaldateien in ImageJ. Klicken Sie auf Bild | Farbe | Zusammenführen und wählen Sie die gewünschte Farbe für jeden Kanal.
2. Erstellen Sie eine Maßstabsleiste, indem Sie Analysieren | Werkzeuge | Skalierungsleiste und fügen Sie sie in die untere rechte Ecke ein. Fahren Sie mit der weiteren Verarbeitung und Analyse gemäß den Bildanforderungen fort. Speichern Sie die zusammengeführten Bilder, wenn Sie fertig sind.

Ergebnisse

Wir führten die Mikrodissektion, Färbung und Bildgebung der PVs in 10 12-16 Wochen alten Mäusen durch. Dem Protokoll folgend, haben wir in allen experimentellen Mäusen erfolgreich PVs zusammen mit dem LA mikrodiseziert und Schnitte mit einer umfassenden Ansicht der PVs in acht Mäusen erhalten. Übersichtsbilder wurden mit 10-facher Vergrößerung aufgenommen, um die PV-Öffnung (PVO) am LA-PV-Übergang, die extrapulmonalen PVs (PV_ex) (PVs zwischen dem Lungenhilum und dem LA-PV-Übergang) und die intrapulm...

Diskussion

Mit diesem Protokoll teilen wir eine Methode zur Unterscheidung und Isolierung der PVs des Mausherzens und führen eine Immunfluoreszenzfärbung durch. Nach der Organentnahme wurden Herz und Lunge in sterilisierter Saccharoselösung dehydriert, gefolgt von der Trennung der Ventrikel vom Vorhof und den Lungenlappen unter mikroskopischer Kontrolle. Danach wurde die Herzbasis vorbereitet, um die PVs zu visualisieren und sie anschließend am Hilum aus der Lunge zu schneiden. Die anschließende Immunfluoreszenzfärbung wurde ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion slides	Epredia	10149870
AF568-secondary antibody	Invitrogen	A11036	Host: Goat, Reactivity: Rabbit
Agarose	Biozym LE	840104
Alexa Fluor 488-secondary antibody	Cell Signaling Technology	4408S	Host: Goat, Reactivity: Mouse
Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody	Abcam	ab11370	Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit
Anti-cTNT antibody	Invitrogen	MA5-12960	Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A2153
Brush	Lukas	5486	size 6
Cover slips	Epredia		24 mm x 50 mm
Cryotome Cryo Star NX70	Epredia		Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C
DFC365FX camera	Leica
DM6 B fluorescence microscope	Leica
Dry ice
Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc.	Gibco	14040133	500 mL
Dumont #5FS Forceps	F.S.T.	91150-20	2 pieces needed
Fine Scissors	F.S.T.	14090-09
Fluorescence mounting medium	DAKO	S3023
Graefe Forceps	F.S.T.	11052-10
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Cell nuclei counterstaining
ImageJ	FIJI		analysis and processing software
LAS X	Leica		Imaging software for Leica DM6 B
Microtome blades S35	Feather	207500000
Microwave
Normal goat serum	Sigma-Aldrich	S26-M
O.C.T. compound	Tissue-Tek	4583
Paraformaldehyde 16%	Pierce	28908	methanol-free
Pasteur pipettes	VWR	612-1681
Petri dish	TPP	93100	100 mm diameter
Rocker 3D digital	IKA Schüttler	00040010000
Slide staining jars	EasyDip	M900-12
Specimen Molds	Tissue-Tek Cryomold	4557	25 mm x 20 mm x 5 mm
StainTray M920 staining system	StainTray	631-1923	Staining system for 20 slides
Sterican Needle	Braun	4657705	G 27 - used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol
Student Vannas Spring Scissors	F.S.T.	91500-09
Super PAP Pen Liquid Blocker	Super PAP Pen	N71310-N
Syringes	Braun	4606108V	10 mL
Tris base	Roche	TRIS-RO	component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS)
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287