Mikrodissektion und Immunfluoreszenzfärbung von Myokardhülsen in murinen Pulmonalvenen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll demonstriert die mikroskopiegesteuerte Isolierung und Immunfluoreszenzfärbung von murinen Pulmonalvenen. Wir bereiten Gewebeproben vor, die den linken Vorhof, die Lungenvenen und die entsprechende Lunge enthalten, und färben sie für kardiales Troponin T und Connexin 43.

Zusammenfassung

Pulmonalvenen (PVs) sind die Hauptursache für ektopische Schläge bei Vorhofrhythmusstörungen und spielen eine entscheidende Rolle bei der Entstehung und dem Fortschreiten von Vorhofflimmern (VHF). PVs enthalten Myokardhülsen (MS), die aus Kardiomyozyten bestehen. MS ist an der Initiierung und Aufrechterhaltung von Vorhofflimmern beteiligt, da sie Ähnlichkeiten mit dem kardialen Arbeitsmyokard bewahrt, einschließlich der Fähigkeit, ektopische elektrische Impulse zu erzeugen. Nagetiere sind weit verbreitet und können hervorragende Tiermodelle für die Untersuchung des Lungenvenenmyokards darstellen, da Kardiomyozyten überall in der Gefäßwand vorhanden sind. Die präzise Mikrodissektion und Präparation von murinen PVs ist jedoch aufgrund der geringen Organgröße und der komplizierten Anatomie eine Herausforderung.

Wir demonstrieren ein mikroskopiegesteuertes Mikrodissektionsprotokoll zur Isolierung des murinen linken Vorhofs (LA) zusammen mit den PVs. Eine Immunfluoreszenzfärbung mit kardialen Troponin-T (cTNT) und Connexin 43 (Cx43) Antikörpern wird durchgeführt, um die LA und PVs in voller Länge sichtbar zu machen. Die Bildgebung mit 10-facher und 40-facher Vergrößerung bietet einen umfassenden Blick auf die PV-Struktur sowie detaillierte Einblicke in die myokardiale Architektur, wobei insbesondere das Vorhandensein von connexin 43 im MS hervorgehoben wird.

Einleitung

Vorhofflimmern ist die häufigste anhaltende Herzrhythmusstörung¹. Die Prävalenz von Vorhofflimmern nimmt mit einer erwarteten Zahl von ~17,9 Millionen Patienten in Europa im Jahr 2060 noch weiter zu¹. Vorhofflimmern ist klinisch von großer Bedeutung, da es ein wesentlicher Risikofaktor für die Entwicklung von Myokardinfarkt, Herzinsuffizienz oder Schlaganfall ist, was zu einer enormen individuellen, sozialen und sozioökonomischen Belastung führt¹. Obwohl Vorhofflimmern seit Jahrzehnten bekannt ist, ist die Pathophysiologie von Vorhofflimmern immer noch nicht vollständig verstanden

Protokoll

Die Tierpflege und alle Versuchsabläufe wurden nach den Richtlinien der Tierpflege- und Ethikkommission der Ludwig-Maximilians-Universität München durchgeführt und alle Verfahren mit Mäusen wurden von der Regierung von Oberbayern genehmigt (ROB 55.2-2532. Vet_02-20-215, ROB 55.2-2532. Vet_02-18-46, ROB 55.2-2532. Vet_02-19-86, ROB 55.2-2532. Vet_02-21-178, ROB 55.2-2532. Vet_02-22-170). C57BL6/N-Mäuse wurden kommerziell gewonnen.

1. Vorbereitung

1. Bereiten Sie ein 3%iges Agarose-Gel vor, indem Sie 3 mg Agarose und 100 ml 1x Tris-gepufferte Kochsalzlösung in einem 500-ml-Erlenmeyerkolben mischen. Erhitzen Sie die Lös....

Diskussion

Mit diesem Protokoll teilen wir eine Methode zur Unterscheidung und Isolierung der PVs des Mausherzens und führen eine Immunfluoreszenzfärbung durch. Nach der Organentnahme wurden Herz und Lunge in sterilisierter Saccharoselösung dehydriert, gefolgt von der Trennung der Ventrikel vom Vorhof und den Lungenlappen unter mikroskopischer Kontrolle. Danach wurde die Herzbasis vorbereitet, um die PVs zu visualisieren und sie anschließend am Hilum aus der Lunge zu schneiden. Die anschließende Immunfluoreszenzfärbung wurde .......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion slides	Epredia	10149870
AF568-secondary antibody	Invitrogen	A11036	Host: Goat, Reactivity: Rabbit
Agarose	Biozym LE	840104
Alexa Fluor 488-secondary antibody	Cell Signaling Technology	4408S	Host: Goat, Reactivity: Mouse
Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody	Abcam	ab11370	Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit
Anti-cTNT antibody	Invitrogen	MA5-12960	Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A2153
Brush	Lukas	5486	size 6
Cover slips	Epredia		24 mm x 50 mm
Cryotome Cryo Star NX70	Epredia		Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C
DFC365FX camera	Leica
DM6 B fluorescence microscope	Leica
Dry ice
Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc.	Gibco	14040133	500 mL
Dumont #5FS Forceps	F.S.T.	91150-20	2 pieces needed
Fine Scissors	F.S.T.	14090-09
Fluorescence mounting medium	DAKO	S3023
Graefe Forceps	F.S.T.	11052-10
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Cell nuclei counterstaining
ImageJ	FIJI		analysis and processing software
LAS X	Leica		Imaging software for Leica DM6 B
Microtome blades S35	Feather	207500000
Microwave
Normal goat serum	Sigma-Aldrich	S26-M
O.C.T. compound	Tissue-Tek	4583
Paraformaldehyde 16%	Pierce	28908	methanol-free
Pasteur pipettes	VWR	612-1681
Petri dish	TPP	93100	100 mm diameter
Rocker 3D digital	IKA Schüttler	00040010000
Slide staining jars	EasyDip	M900-12
Specimen Molds	Tissue-Tek Cryomold	4557	25 mm x 20 mm x 5 mm
StainTray M920 staining system	StainTray	631-1923	Staining system for 20 slides
Sterican Needle	Braun	4657705	G 27 - used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol
Student Vannas Spring Scissors	F.S.T.	91500-09
Super PAP Pen Liquid Blocker	Super PAP Pen	N71310-N
Syringes	Braun	4606108V	10 mL
Tris base	Roche	TRIS-RO	component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS)
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287