Ein Rattenmodell für zusammengesetzte Akne

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Induktion von Akneentzündungen in der Rattenhaut mit Ölsäure und Cutibacterium acnes.

Zusammenfassung

Akne vulgaris ist eine weit verbreitete chronische Hauterkrankung, die durch das Vorhandensein von Komedonen, Papeln und Pusteln im Gesicht, am Hals und auf der Brust gekennzeichnet ist. Um die Entzündung von Akne vulgaris zu simulieren, beschreibt dieses Protokoll einen Ansatz zur Etablierung eines zusammengesetzten Akne-Nagetiermodells durch Induktion einer Akneentzündung in Rattenohren unter Verwendung von Ölsäure und Cutibacterium acnes (C. acnes). Die Ratten wurden nach dem Zufallsprinzip in vier Gruppen eingeteilt: die normale Kontrollgruppe (NC), die Ohren, die mit Ölsäure (OA) behandelt wurden, die Ohren, die mit der C. acnes-Gruppe (C. acnes) behandelt wurden, die Ohren, die mit Ölsäure und C. acnes (OA + C. acnes) behandelt wurden. Um eine übermäßige Talgproduktion nachzuahmen, wurde Ölsäure 25 Tage lang auf die Ohren von Ratten in den Gruppen OA und OA + C. acnes geschmiert .

Von den Tagen 21 bis 25 wurde C. acnes-Suspension intradermal in die Ohren von Ratten der Gruppen C. acnes und OA + C. acnes injiziert, um die Akneentzündung zu verschlimmern. Die Ohrdicke wurde wöchentlich gemessen, um den Schweregrad der Entzündung zu messen. Es wurden grobe Beobachtungen, Hämatoxylin- und Eosin-Färbungen und Immunhistochemie (IHC) durchgeführt und die Ergebnisse zeigten, dass die Ohren der OA-Gruppe und der OA + C. acnes-Gruppe verdickt und verhärtet waren, begleitet von Erythem und dem Vorhandensein von Komedonen. Zusätzlich wurden Papeln in den Gruppen C. acnes und OA + C. acnes beobachtet. Die Histopathologie zeigte eine Hyperkeratinisierung und ein erweitertes Infundibulum der Haarfollikel in den Gruppen OA und OA + C. acnes . Infiltrationen von Entzündungszellen und Abszessen wurden in der Dermis der Gruppen C. acnes und OA + C. acnes gefunden. Die IHC-Ergebnisse bestätigten erhöhte Spiegel des Tumornekrosefaktors (TNF)-α in der Dermis der Gruppen C. acnes und OA + C. acnes . Alle oben genannten Ergebnisse zeigten zusammen die erfolgreiche Etablierung des zusammengesetzten Akne-Nagetiermodells.

Einleitung

Akne vulgaris ist eine häufige chronische Hauterkrankung, die durch das Vorhandensein von Komedonen, Papeln und Pusteln im Gesicht, am Hals und an der Brust gekennzeichnet ist und in schweren Fällen zu Knötchen, Zysten und bleibenden Narben führen kann¹. Epidemiologische Studien berichten, dass 9,4 % der Weltbevölkerung von Akne betroffen sind, während die daraus resultierenden Symptome schwerwiegende körperliche und psychosoziale Herausforderungen darstellen ^2,3.

Die Pathogenese der Akne ist multifaktoriell und umfasst vier kritische Prozesse: übermäßige Talgproduktion, Komedonenbildung, follikuläre Besiedlung durch Hautmikrobiota und die Freisetzung von Entzündungsmediatoren um die Talgdrüseneinheit ^4,5. Eine erhöhte Talgsekretion, die zur Ansammlung von überschüssigen ungesättigten freien Fettsäuren (UFFAs) führt, trägt zu einer abnormalen Reproduktion der Hautmikrobiota bei, zu der auch Cutibacterium acnes gehört, wie in genomischen Studien^{gezeigt wurde 6}. In der Zwischenzeit zersetzt die Hautmikrobiota den Talg und erhöht die Konzentration von UFFAs, was zu einem Teufelskreis führt⁷. Darüber hinaus verursachen überschüssige UFFAs eine Hyperkeratinisierung in den Haarfollikeln, die wiederum Akne⁸ auslöst. Sowohl die Hautmikrobiota als auch der erhöhte Talg aktivieren Toll-like-Rezeptoren (TLRs), um mehrere proinflammatorische Zytokine wie Interleukin (IL)-1 und TNF-α^zu produzieren ^9,10. Diese Entzündungskaskade, gepaart mit vermehrtem Talg und mikrobieller Überwucherung, gipfelt in einer ausgeprägten Hyperkeratose des Haarfollikels und dem Auftreten von Akne¹¹.

Die rasante Entwicklung auf dem Gebiet der Akneforschung und der damit verbundenen klinischen Anforderungen hat zur Erstellung einer Reihe von Tiermodellen für Akneentzündungen am Rattenohr, am Rücken von Ratten oder Mäusen und am Kaninchenohr geführt ^12,13,14,15. Zu den Methoden gehört die intradermale Injektion von C. Akne, das Auftragen von Ölen auf die Haut, um die abnormale Sekretion der Talgdrüsen und die Hyperkeratinisierung zu simulieren, oder eine Kombination aus beidem, um die Hautentzündung zu beschleunigen und Akne zu bilden 16,17,18,19. Die Verwendung und Dosierung von chemischen und biologischen Wirkstoffen variiert jedoch zwischen früheren Studien, was Forscher verwirren kann, die beabsichtigen, ein geeignetes Aknemodell zu etablieren. Diese Studie zielte darauf ab, eine einfach zu bedienende und effektive Methode zur Bildung eines zusammengesetzten Akne-Nagetiermodells zu etablieren und eine Modellreferenz für Forscher zu liefern, die Akne vulgaris untersuchen.

Protokoll

Dieses Protokoll wurde von der Beijing University of Chinese Medicine ethisch genehmigt (Nr. 2023033103-1183). Zwölf männliche Sprague-Dawley-Ratten (Gewicht, 208 g ± 5 g) wurden in diesem Protokoll verwendet und in vier Gruppen eingeteilt: NC-Gruppe (n = 3), OA-Gruppe (n = 3), C. acnes-Gruppe (n = 3) und OA + C. acnes-Gruppe (n = 3).

1. Entwicklung des Akne-Modells

1. Messen und notieren Sie die Dicke von Rattenohren mit einem elektronischen Messschieber (siehe Materialtabelle), bevor Sie modellieren.
   1. Platzieren Sie die Außenbacke des elektronischen Messschiebers in der Mitte des äußeren Ohrrandes und verlängern Sie sie in den Gehörgang. Notieren Sie die Dicke von 2/3 Punkten und die Dicke von 1/2 Punkten entlang der Linie. Messen Sie jeden Punkt 3x und berechnen Sie die Durchschnittswerte der Dicke von zwei Punkten, um die Dicke des Ohrs zu berücksichtigen.
2. Neigen Sie den Kopf der Ratte zur Seite, richten Sie das Ohr nach oben und tragen Sie 50 μl Ölsäure (siehe Materialtabelle) gleichmäßig auf, einmal täglich, für 25 Tage, auf die ventrale und dorsale Seite des Ohrs.
3. Von Tag 21 bis Tag 25 täglich vor der Anwendung von Ölsäure die Ratten mit 4% Isofluran anästhesieren und dann 50 μl 1 × 10⁷ KBE C. Akne-Suspension (siehe Materialtabelle) intradermal in die ventrale Oberfläche des Ohrs injizieren, wobei eine 1-ml-Spritze mit einer 34 G oder 36 G Nadel (siehe Materialtabelle) verwendet wird.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, Blutgefäße im Ohr zu vermeiden, wenn Sie intradermal injizieren. Eine Mikrospritze mit einer 34 G oder 36 G Nadel (siehe Materialtabelle) ist erforderlich. Um eine ordnungsgemäße intradermale Injektion zu gewährleisten, sollte die Nadel in einem Winkel von 10 bis 15 Grad mit einer Tiefe von ca. 1 mm punktiert werden.
4. Messen und notieren Sie am 25. Tag die Dicke der Ohren, wie in Schritt 1.1 beschrieben.
   HINWEIS: Die OA-Gruppe wurde nur vom 21. bis zum 25. Tag mit Ölsäure bestrichen, wie in Schritt 1.2 beschrieben, und mit Kochsalzlösung injiziert. Die C. acnes-Gruppe wurde nur intradermal mit C. acnes-Suspension injiziert, wie in Schritt 1.3 beschrieben. Die OA + C. acnes-Gruppe wurde mit Ölsäure und C. acnes-Suspension behandelt, wie in den Schritten 1.2 und 1.3 beschrieben.

2. Gewebeentnahme und -analyse

1. Am 26. Tag, nachdem die Ratten mit einer institutionell anerkannten Methode human eingeschläfert wurden, bohren Sie mit einem 8-mm-Ringbohrer feste Größe auf beide Ohren.
2. Tauchen Sie das Ohrgewebe 24 Stunden lang in 4 % Paraformaldehyd, anschließend wird Paraffin eingebettet und in 5 μm dicke Scheiben geschnitten, um Hämatoxylin- und Eosin (HE)-Färbung²⁰ % zu erhalten. Betrachten Sie die Schnitte unter einem Lichtmikroskop und zeichnen Sie die pathologischen Veränderungen für die Nachuntersuchung durch einen Pathologen auf. Ordnen Sie den pathologischen Veränderungen gemäß Tabelle 1 Punkte zu (siehe auch Abbildung 1).
3. Entparaffinieren, rehydrieren und erhitzen Sie die Schnitte für die Antigengewinnung. Endogene Peroxidasen inaktivieren, indem 15 min bei Raumtemperatur mit 0,3 %_H2O₂ in Methanol inkubiert wird.
4. Waschen Sie die Schnitte mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und inkubieren Sie sie dann 30 min lang bei Raumtemperatur mit 3% BSA.
5. Die Schnitte werden über Nacht mit einem monoklonalen TNF-α-Antikörper (Verdünnung 1:800) (siehe Materialtabelle) bei 4 °C inkubiert.
6. Waschen Sie die Schnitte erneut mit PBS und inkubieren Sie sie mit Meerrettichperoxidase-konjugierten Sekundärantikörpern (siehe Materialtabelle) für 50 min.
7. Nach einer weiteren PBS-Wäsche wird das 3,3'-Diaminobenzidin (DAB)-Gemisch auf die Objektträger aufgetragen und der Färbeprozess unter einem Mikroskop überwacht, wobei die Reaktion mit PBS gestoppt wird, wenn die gewünschte Intensität erreicht ist.
8. Färben Sie die Abschnitte 1 Minute lang mit Meyer's Hämatoxylin gegen, spülen Sie sie mit fließendem Wasser ab, trocknen Sie sie und montieren Sie die Abschnitte. Betrachten Sie die Schnitte unter dem Mikroskop und zeichnen Sie die pathologischen Veränderungen für die Nachuntersuchung durch einen Pathologen auf.

3. Statistische Analyse

1. Führen Sie statistische Analysen durch.
2. Geben Sie die Daten als Mittelwert ± Standardabweichung an. Greifen Sie mit dem Shapro-Wilke-Test auf die Normalverteilung aller Daten zu. Wenn sie einer Normalverteilung folgt, verwenden Sie die unidirektionale ANOVA, um signifikante Unterschiede zu bewerten. Für nicht normalverteilte Daten wenden Sie den Kruskal-Wallis-Test an, gefolgt von den Mehrfachvergleichen von Dunn. Ein p-Wert kleiner als 0,05 gilt als statistisch signifikant.

Ergebnisse

Dicke und Aussehen der Haut
Von Tag 7 bis Tag 21 waren die Ohren in der OA-Gruppe und der OA + C. acnes-Gruppe signifikant dicker als die der NC- und C. acnes-Gruppen . An Tag 25 waren die Ohren in der OA-Gruppe, der C. acnes-Gruppe und der OA + C. acnes-Gruppe signifikant dicker als die der NC-Gruppe (p < 0,05). Die durchschnittliche Dicke der Ohren während des Versuchs ist in Abbildung 2 und...

Diskussion

Da die Methodik und die Bewertungskriterien für ein Aknemodell nicht klar waren, zielte dieses Protokoll darauf ab, Forschern, die Akne untersuchen, eine Referenz zu bieten. Aufgrund der geringen Größe des Mausohrs und der Interferenz, die durch wachsende Haare auf dem Rücken, die Verwendung von Enthaarungscreme und einem Rasierer verursacht wird, kann das Ohr der Ratte eine bessere Alternative sein, um ein Nagetiermodell für Akne zu etablieren. Wir hatten versucht, das Akne-Modell ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anaero-indicator	Mitsubishi, Japan	C-22
AnaeroPack	Mitsubishi, Japan	C-11, C-41
Columbia blood agar plate	BeNa Cuture Collection, China	BNCC330605
Constant temperature incubator	SHANGCHENG, China	303-0
Cotton swab	HYNAUT, China	_
Cutibacterium acnes	BeNa Cuture Collection, China	BNCC330605
Dako REAL EnVision Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse	DAKO, Denmark	K5007
disposable sterile injection needle	Zhejiang Oujian Medical Apparatus, China	_
Electronic scale	JINXUAN, China	A017
Electronic vernier caliper	Deli, China	DL90150
Oleic acid (Analytical reagent, AR)	Fangzheng, China	_
Sodium chloride injection	CR Double CRANE, China	Y2212241
SPSS Statistics	IBM, USA	26.0
sterile hypodermic syringes	Shandong weigao group medical polymer, China	_
TNF Alpha Monoclonal antibody	Proteintech Group,int, USA	60291-1-lg