Störung der Blut-Hirn-Schranke der Maus durch kleine extrazelluläre Vesikel aus hypoxischen menschlichen Plazenta

Zusammenfassung

Es wird ein Protokoll vorgestellt, um zu evaluieren, ob kleine EVs (sEVs), die aus Plazenta-Explantaten isoliert wurden, die unter hypoxischen Bedingungen kultiviert wurden (ein Aspekt der Präeklampsie modellierend), die Blut-Hirn-Schranke bei nicht schwangeren erwachsenen weiblichen Mäusen stören.

Zusammenfassung

Zerebrovaskuläre Komplikationen, einschließlich Hirnödeme sowie ischämischer und hämorrhagischer Schlaganfall, sind die Hauptursache für die mütterliche Sterblichkeit im Zusammenhang mit Präeklampsie. Die zugrundeliegenden Mechanismen dieser zerebrovaskulären Komplikationen sind noch unklar. Sie werden jedoch mit Plazentafunktionsstörungen und einer Störung der Blut-Hirn-Schranke (BHS) in Verbindung gebracht. Dennoch wird die Verbindung zwischen diesen beiden entfernten Organen noch ermittelt. Immer mehr Hinweise deuten darauf hin, dass die Plazenta Signalmoleküle, einschließlich extrazellulärer Vesikel, in den mütterlichen Kreislauf abgibt. Extrazelluläre Vesikel werden nach ihrer Größe kategorisiert, wobei kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs mit einem Durchmesser von weniger als 200 nm) sowohl unter physiologischen als auch unter pathologischen Bedingungen als kritische Signalpartikel gelten. Bei der Präeklampsie kommt es zu einer erhöhten Anzahl zirkulierender sEVs im mütterlichen Kreislauf, deren Signalfunktion nicht gut verstanden ist. Plazenta-sEVs, die bei Präeklampsie oder aus einer normalen Schwangerschaftsplazenta freigesetzt werden, die einer Hypoxie ausgesetzt sind, induzieren eine endotheliale Dysfunktion des Gehirns und eine Störung der BHS. In diesem Protokoll untersuchen wir, ob sEVs, die aus plazentaren Explantaten isoliert wurden, die unter hypoxischen Bedingungen kultiviert wurden (die einen Aspekt der Präeklampsie modellieren), die BHS in vivo stören.

Einleitung

Etwa 70 % der mütterlichen Todesfälle aufgrund von Präeklampsie, einem hypertensiven Schwangerschaftssyndrom, das durch gestörte Plazentationsprozesse, mütterliche systemische endotheliale Dysfunktion und in schweren Fällen durch Multiorganversagen ^1,2 gekennzeichnet ist, sind mit akuten zerebrovaskulären Komplikationen assoziiert ^3,4. Die meisten Todesfälle von Müttern treten in Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen auf⁵. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind jedoch trotz der klinischen und epidemiologischen Relevanz z....

Protokoll

Die Forschung wurde nach den in der Deklaration von Helsinki formulierten Prinzipien und mit Genehmigung der jeweiligen Ethik-Prüfungsausschüsse durchgeführt. Alle menschlichen Teilnehmer gaben vor der Probenentnahme ihre Einverständniserklärung, wie bereits berichtet²⁵. Darüber hinaus hat die Kommission für Bioethik und Biosicherheit der Universität Bío-Bío dieses Projekt genehmigt (Fondecyt-Stipendium 1200250). Die Tierarbeit wurde in Übereinstimmung mit den Grundprinzipien der drei R's bei der Verwendung von Tieren in Versuchen³⁵ und gemäß den Empfehlungen der Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren ....

Ergebnisse

Dieses Protokoll bewertet die Fähigkeit von sEVs, die aus Plazenten gewonnen werden, die in Hypoxie kultiviert wurden, die BHS bei nicht schwangeren Mäusen zu stören. Diese Methode ermöglicht es, die mögliche Verbindung zwischen der Plazenta und dem Gehirn unter normalen und pathologischen Bedingungen besser zu verstehen. Insbesondere kann diese Methode einen Proxy für die Analyse der Beteiligung von plazentaren sEVs am Auftreten von zerebralen Komplikationen bei Präeklampsie darstellen.

Diskussion

Diese Studie enthüllt neue Erkenntnisse über mögliche Schäden, die sich aus Plazenta-Explantaten isolieren, die unter hypoxischen Bedingungen kultiviert wurden, auf die Störung der Blut-Hirn-Schranke von Nagetieren ergeben. Der pathologische Mechanismus beinhaltet eine Reduktion von CLND-5 in der hinteren Hirnregion²⁵.

Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass Plasma-sEVs von Personen mit Präeklampsie eine endotheliale Dysfunktion in verschiedenen Organen unter .......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult mice brain slecer matrice 3D printed	Open access file	Adult mice	Adult mice brain slicer. Printed in PLA filament.
Anti β-Actin primary antibody	Sigma-Aldrich	Clon AC-74	Antibody for loading control (Western blot)
Anti-Claudin5 primary antibody	Santa cruz Biotechnology	sc-374221	Primary antibody for tight junction protein CLDN5 of mice BBB (Western blot)
BCA protein kit	Thermo Scientific	23225	Kit for measuring protein concentration
Culture media #200 500 mL	Thermo Fisher Scientific	m200500	Culture media for placental explants
D180 CO2 incubator	RWD Life science	D180	Standard incubator to estabilize explants and culture sEVs-Nor
Evans blue dye  > 75% 10 g	Sigma-Aldrich	E2129.10G	Dye to analize blood brain barrier disruption IN VIVO
Fetal bovine serum 500 mL	Thermo Fisher Scientific	16000044	Additive growth factor for culture media 200
Himac Ultracentrifuge CP100NX	Himac eppendorf group	5720410101	Ultracentrifuge for condicioned media > 1,20,000 x g
ImageJ software	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Isoflurane x 100 mL	USP Baxter	212-094	Volatile inhalated anaesthesia agent for mice
Kit CellTiter 96 Non-radioactive	Promega	0000105232	In vitro assay for placental explants viability
Mouse IgG Secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	MO 63103	Secondary antibody for CLDN5 (western blot)
NanoSight NS300	Malvern Panalytical	90278090	Nanotracking analysis of particles from placental explants condicioned media
Paraformaldehide E 97% solution 500 mL	Thermo Fisher Scientific	A11313.22	Fixative solution for brain tissue slices and intracardial perfusion (once diluted)
PBS 1 X pH 7.4 500 mL	Thermo Fisher Scientific	10010023	Wash solution for placenta explants
Peniciline-streptomicine 100x 20 mL	Thermo Fisher Scientific	10378016	Antiobiotics for placental explants culture media
ProOX C21 Cytocentric O2 and CO2 Subchamber Controller	BioSpherix	SCR_021131	CO2 regulator to induce Hypoxia in sealed chamber for sEVs-Hyp
Sodium Thiopental 1 g	Chemie	7061	humanitarian euthanasia agent
Somnosuite low flow anesthesia system	Kent Scientifics	SS-01	Isoflurane vaporizer for small rodents
Surgical Warming platform	Kent Scientifics	A41166	Warming platform for mainteinance anesthesia in mice
Syringe Filters, Polytetrafluoroethylene (PTFE), Hydrophobic, 0.22 µm, Sterile, 25 mm	Southern labware	10026	Filtration of condicioned media harvested from placental explants
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges HITACHI himac CT15E/CT15RE	Hitachi medical systems	6020	Serial centrifugations of condicioned media < 1,20, 000 x g
Trinocular stereomicroscope transmided and reflective light 10x-160x	Center Medical	2597	Stereomicroscope to register brain slices