Eine effiziente und schnelle Methode zur Markierung und Analyse von Mausglomeruli

Zusammenfassung

Diese Studie stellt eine einfach anzuwendende, vollständige und einfache Reihe von Methoden zur Markierung und Analyse von Glomeruli aus CUBIC-geräumten Mäusenieren vor. Daten wie Glomeruluszahl und -volumen können einfach und zuverlässig mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-Dextran, Lichtblattfluoreszenzmikroskopie (LSFM) oder gängiger konfokaler Mikroskopie und Software wie Imaris gewonnen werden.

Zusammenfassung

Die Glomeruli sind grundlegende Einheiten in der Niere; Daher ist die Untersuchung der Glomeruli von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Nierenfunktion und -pathologie. Die biologische Bildgebung liefert intuitive Informationen; Daher ist es von großer Bedeutung, die Glomeruli zu beschriften und zu beobachten. Die derzeit verwendeten Glomeruli-Beobachtungsmethoden erfordern jedoch komplizierte Operationen, und die Ergebnisse können Markierungsdetails oder dreidimensionale (3D) Informationen verlieren. Die klare, ungehinderte Brain-Imaging-Cocktails und die Computational Analysis (CUBIC)-Gewebereinigungstechnologie sind in der Nierenforschung weit verbreitet und ermöglichen eine genauere Detektion und eine tiefere Detektionstiefe. Wir fanden heraus, dass Maus-Glomeruli schnell und effektiv durch Schwanzveneninjektion von mittelmolekularem FITC-Dextran gefolgt von der CUBIC-Clearing-Methode markiert werden können. Die gereinigte Mausniere konnte mit einem Lichtblattmikroskop (oder einem konfokalen Mikroskop, wenn sie geschnitten wurde) gescannt werden, um dreidimensionale Bildstapel aller Glomeruli in der gesamten Niere zu erhalten. Mit entsprechender Software verarbeitet, konnten die Glomeruli-Signale leicht digitalisiert und weiter analysiert werden, um die Anzahl, das Volumen und die Frequenz der Glomeruli zu messen.

Einleitung

Die Anzahl und das Volumen der Glomeruli sind sehr wichtig für die Diagnose und Behandlung verschiedener Nierenerkrankungen 1,2,3,4,5. Der goldene Standard der Glomeruli-Zahlschätzung ist die Kombination aus physikalischem Dissektor und Fraktionierer. Diese Methode erfordert jedoch spezielle Reagenzien und Geräte, was sie langsam und teuer macht 6,7,8,9. Die Biopsie liefert eine Fülle von Informationen, aber offensichtlich ist diese Methode nur für grobe Schätzungen geeignet^10,11. Medizinische Bildgebungstechnologien, einschließlich Magnetresonanztomographie (MRT), Computertomographie (CT) und Röntgen, sind ebenfalls bei der glomerulären Detektion weit verbreitet 12,13,14,15, aber solche Technologien erfordern sperrige Instrumente. Neue Methoden, wie z. B. das matrixgestützte Laserdesorptions-/Ionisations-Massenspektrometer¹⁶ oder das Dick- und Dünnschliffverfahren¹⁷, wurden ebenfalls in der glomerulären Detektion eingesetzt, obwohl sie nach wie vor mühsam und mühsam sind.

Mit Hilfe von Transparenztechnologien ist es möglich, tiefere Tiefen zu beobachten und reichhaltigere und vollständigere Informationen aus dickem Gewebe oder sogar ganzen Organen zu erhalten 18,19,20,21,22,23. Daher sind Transparenztechnologien in der Nierenforschung weit verbreitet²⁴. Auch die Beobachtung und der Nachweis von Glomeruli in den gereinigten Nieren gehören dazu. Diese veröffentlichten Artikel bezogen sich jedoch entweder nur kurz auf den glomerulären Nachweis²⁵ oder verwendeten schwierig zu erreichende Markierungsmethoden wie transgene Tiere²⁶, selbst hergestellte Farbstoffe¹³ oder hochkonzentrierte Antikörperinkubation²⁷ zur Markierung der Glomeruli. Obwohl Studien Glomeruli in gereinigten Nieren analysiert hatten, waren die Analysen immer begrenzt¹³ oder stützten sich auf Analysealgorithmen, die von den Autoren selbst entwickelt wurden²⁶.

Wir haben bereits einen bequemeren Weg zur Markierung der Glomeruli in den Nieren von Mäusen gezeigt²⁸. Durch die Verwendung von Imaris stellten wir fest, dass die Anzahl, Häufigkeit und das Volumen der Glomeruli schnell ermittelt werden konnten. Daher stellen wir hier einen zugänglicheren, umfassenderen und vereinfachten Satz von Methoden zur Markierung und Analyse der Glomeruli von Mäusenieren vor.

Protokoll

In dieser Studie wurden adulte C57BL/6-Mäuse (6 Wochen alt, 25-30 g) verwendet. Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den lokalen Vorschriften des Tierschutzes und der experimentellen Ethik durchgeführt. Die Studie wurde von der Ethikkommission für biomedizinische Forschung des Westchinesischen Krankenhauses der Universität Sichuan genehmigt.

1. Glomeruli-Markierung und Gewebevorbereitung

1. Glomeruli-Etikettierung
   1. FITC-Dextran (10 mg) wird in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) im Verhältnis 1:1 (1 mg: 1 ml) gelöst, um die Arbeitssondenlösung herzustellen.
      HINWEIS: Die Arbeitslösung kann 1 Monat lang bei 4 °C gelagert werden.
   2. Legen Sie die C57-Maus in einen Mausschwanzvenen-Fixateur. Befeuchten Sie die Gaze mit heißem Wasser, wickeln Sie die Gaze um den mittleren Teil des Mäuseschwanzes und erwärmen Sie den Schwanz 1 Minute lang.
   3. Wischen Sie den Mäuseschwanz mit 75%igem Ethanol ab, bis die linke und rechte Schwanzvene sichtbar sind.
   4. Ziehen Sie 100 μl der Arbeitssondenlösung mit einer 1-ml-Insulinspritze und injizieren Sie die Lösung langsam in die Schwanzvene der Maus.
   5. Nach der Injektion die Sondenlösung 30 Minuten lang zirkulieren lassen. Lassen Sie die Mäuse sich in ihren Käfigen frei bewegen.
   6. Sobald eine ausreichende Durchblutung erreicht ist, werden die Mäuse durch intraperitoneale Injektion von Natrium-Pentobarbital (1%, 60-80 μg/kg) tief betäubt.
2. Nierenentnahme und -fixierung
   1. Befestigen Sie die anästhesierten Mäuse in Rückenlage an der anatomischen Platte. Befestigen Sie ihre Pfoten mit medizinischem Klebeband.
   2. Nach der Hautvorbereitung werden die Mäuse mit einer tödlichen Dosis Natrium-Pentobarbital (1%, 10 mg/kg) eingeschläfert.
   3. Machen Sie einen Bauchschnitt in der Mittellinie, um die Bauchhöhle freizulegen.
   4. Legen Sie die Nieren frei und entfernen Sie sie mit einem Skalpell und einer Schere aus dem Abzug. Entfernen Sie die Nierenhülle vorsichtig.
   5. Sammeln Sie die Nieren und fixieren Sie sie in 4% Paraformaldehyd (PFA) bei 4 °C über Nacht.
   6. Waschen Sie die Proben mit PBS dreimal jeweils 1 h unter Schütteln bei Raumtemperatur (RT).
   7. Bereiten Sie die Niere für die Mikroskopie vor.
      1. Schneiden Sie die Niere für die konfokale Mikroskopie: Schneiden Sie die Niere mit Hilfe der Gehirnmatrix (1 mm Stahl, 40-75 g) in 1 mm dicke Scheiben, um die Schichtdicke zu standardisieren. Die Scheiben in 4% PFA überführen und die Fixierung bei 4 °C über Nacht fortsetzen.
      2. Ganze Niere für die Lichtblattmikroskopie: Fixieren Sie die Nieren in 4% PFA bei 4 °C für 48 Stunden.

2. Verrechnung

1. Vorbereitung der Reagenzien
   1. Bereiten Sie das CUBIC-L-Reagenz vor, indem Sie 10 % (Gew./Gew.) N-Butyldiethanolamin, 10 Gew.-% (Gew./Gew.) Triton X-100 und 80 %_ddH2O mischen.
   2. Bereiten Sie das CUBIC-R-Reagenz vor, indem Sie 45 % (wt/wt) Antipyrin, 30 % (wt/wt) Nicotinamid, 0,5 % (vol/vol) N-Butyldiethanolamin und 24,5 %_ddH2Omischen. Stellen Sie sicher, dass die Lösung einen pH-Wert von 9,6-9,8 und einen Brechungsindex (RI) von 1,522 hat.
      HINWEIS: CUBIC-L wird für die Delipidierung und CUBIC-R für die Anpassung des Brechungsindex verwendet.
2. Clearing-Verfahren
   1. Die Nierenproben werden in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen gesammelt und dann in CUBIC-L unter Schütteln bei 60 U/min bei 37 °C gereinigt. Tauschen Sie CUBIC-L alle 4 Stunden (für Nierenscheiben) oder alle 24 Stunden (für eine ganze Niere) aus, bis eine zufriedenstellende optische Transparenz erreicht ist.
      HINWEIS: Dieser Vorgang dauert 1 Tag für Nierenscheiben und 5 Tage für eine ganze Niere.
   2. Waschen Sie die Proben dreimal in PBS mit leichtem Schütteln bei RT für jeweils 1 Stunde.
   3. CUBIC-R auf die Proben auftragen und die Proben 6 h lang bei 37 °C und 60 U/min schütteln.
   4. Beobachten Sie die geklärten Proben direkt oder lagern Sie sie 1 Woche lang in schwarzen Röhrchen, die mit CUBIC-R bei RT gefüllt sind.

3. Bildaufnahme

1. Konfokale Bildgebung
   HINWEIS: Fotografieren Sie die geschnittenen Nierenproben mit konfokaler Mikroskopie (Objektive: Ein Plan Apo λ 4×/0.2 N1 Objektiv oder ein Plan Apo VC 10×/0.45 DIC N1 Objektiv). Erfassen Sie große Bilder (z. B. 6052 μm x 6052 μm für die Nierenschicht) mit Z-Stapeln.
   1. Schalten Sie das konfokale Mikroskop in der folgenden Reihenfolge ein: Laserleistung, konfokaler Steuerschalter, Computer, Mikroskop und konfokale Hardware. Schalten Sie nach dem Ausführen des Selbsttests die konfokale Software ein.
   2. Wählen Sie das entsprechende Objektiv aus. Nehmen Sie die Probe aus dem CUBIC-R-Reagenz, legen Sie sie in die konfokale Schale und decken Sie sie ab, um ein Austrocknen des CUBIC-R-Reagenzes zu verhindern.
   3. Verschieben Sie die Probe in die Mitte des Sichtfelds und passen Sie die Fokusebene an, bis sie scharf ist.
   4. Wenden Sie die 3D-Rekonstruktion (Schritt 3.1.4.1) und die Rekonstruktion großer Bilder (Schritte 3.1.4.2-3.1.4.3) an.
      1. 3D-Rekonstruktion (konfokal): Schalten Sie die Zoomebene in eine Richtung, bis keine Fluoreszenz mehr sichtbar ist; Diese Position wird als Spitze definiert. Schalten Sie dann die Zoomebene in die entgegengesetzte Richtung, bis keine Fluoreszenz mehr sichtbar ist. Diese Position wird als Boden definiert. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen in der unteren rechten Ecke des Dialogfelds, um den Scanvorgang zu starten.
      2. Große Bildrekonstruktion (konfokal): Verschieben Sie das Sichtfeld in die Mitte der Probe und legen Sie die aktuelle Position als Mittelpunkt fest. Wählen Sie ein 2 x 2-Sichtfeld aus.
      3. Wählen Sie in der ND-Multifunktionsschnittstelle den Z-Stapel aus, um große Bilder zu rekonstruieren, und legen Sie verschiedene Optionen im Bedienfeld fest. Drücken Sie dann die Taste Ausführen , aber, um den Scanvorgang zu starten.
2. Bildgebung der Lichtblattfluoreszenzmikroskopie (LSFM)
   HINWEIS: Fotografieren Sie die gesamten Nieren mit einem Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskop (Objektiv: EC Plan-Neofluar 5x/0,16 (Medium n = 1,529) Objektiv).
   1. Probenanbringung (LSFM):
      1. Kleben Sie die durchsichtige Niere auf den Adapter zur Probenfixierung und warten Sie, bis die Niere fest befestigt ist.
      2. Weichen Sie die Niere in den Probenbehälter ein und schieben Sie den Probenbehälter in das Mikroskopsystem. Schließen Sie die Luke.
   2. Beobachten und scannen (LSFM):
      1. Verschieben Sie die Probe in der Lokalisierungsschnittstelle an eine geeignete Beobachtungsposition. Wechseln Sie zur Erfassungsschnittstelle , stellen Sie den optischen Pfad ein, wählen Sie 488-nm-Laser, LBF 405/488/561/640, optischen Splitting-Filterblock SBS LP 490, wählen Sie Kamera 2 und ändern Sie die Pseudofarbe in Grün.
      2. Geben Sie den Wert für den Z-Versatz links/rechts ein, der zuvor im Untermenü Kanal aufgezeichnet wurde. Wählen Sie den kleinsten Zoom (0,36) und passen Sie ihn für maximale Klarheit an.
   3. Finde die X\Y-Grenze und den Z-Bereich des gesamten Organs. Stellen Sie die Laserintensität und die Belichtungszeit ein (vorzugsweise weniger als 10 ms) und klicken Sie auf Ausführen , um zu starten.
   4. Wenn das Gewebe zu groß ist, fügen Sie zwei oder mehr Bilder mit Bildzusammenfügen zusammen. Öffnen Sie die aufgenommene Datei mit der Mikroskopie-Software (hier ZEISS ZEN 3.7). Wählen Sie Verarbeitung > Methode > Stitching > Methodenparameter > Auf vollständiges Bild-Stitching anwenden.

4. Datenverarbeitung und Quantifizierung

HINWEIS: Verarbeiten Sie die Bildstapel mit der Software Imaris (Bildanalyse), indem Sie die Funktion Oberfläche verwenden, um die Glomeruli zu beschriften und eine Analyse durchzuführen.

1. Graf der Glomeruli
   1. Importieren Sie große Bilder (konfokale Mikroskopie) oder zusammengefügte Bilder (Lichtblattmikroskopie) in die Bildanalysesoftware.
   2. Öffnen Sie die Dateien in der Bildanalysesoftware. Klicken Sie auf die Schaltfläche Oberfläche , um eine neue Oberfläche zu erstellen. Folgen Sie der Anleitung unten links auf dem Bildschirm.
      1. Klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter (Pfeil nach rechts), ohne etwas anzukreuzen.
      2. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen vor der Option Glätten und geben Sie eine geeignete Zahl ein (z. B. 14,5), um die Details der Oberfläche zu steuern. Wählen Sie Hintergrundsubtraktion in Schwellenwert und füllen Sie das Feld mit dem ungefähren durchschnittlichen Durchmesser der Glomeruli. Klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter .
      3. Passen Sie die Einstellungen bei Bedarf an und klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter . Wählen Sie den richtigen Bereich aus, und klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter , um eine Oberfläche zu erstellen.
   3. Klicken Sie auf "Filter" und dann auf die Schaltfläche "Hinzufügen ", um "Sphärizität " hinzuzufügen und nicht-sphärische Objekte herauszufiltern. Klicken Sie auf die Schaltfläche Duplizieren , um diese neue Oberfläche zu kopieren.
   4. Klicken Sie auf die Taste "Statistik" und dann auf die Schaltfläche "Gesamt ". Die Software zeigt die Anzahl der Glomeruli als Gesamtanzahl der Oberfläche an.
2. Volumen der Glomeruli
   1. Erstelle eine Oberfläche der Glomeruli wie oben.
   2. Wenn die Oberfläche fertig ist, klicken Sie auf die Schaltfläche Auswahl , um die Zielobjekte auszuwählen und das Volumen jedes Objekts darzustellen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern und exportieren Sie die Statistiken zur weiteren Analyse in eine Tabelle.
3. Volumen der Scheibe oder der ganzen Niere
   1. Importieren Sie große Bilder (konfokale Mikroskopie) oder zusammengefügte Bilder (Lichtblattmikroskopie) in die Bildanalysesoftware.
   2. Öffnen Sie Dateien in der Bildanalyse-Software. Klicken Sie auf die Schaltfläche Oberfläche , um eine neue Oberfläche zu erstellen. Folgen Sie der Anleitung unten links auf dem Bildschirm.
      1. Klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter (Schaltfläche mit dem Pfeil nach rechts), ohne ein Häkchen zu setzen.
      2. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen vor der Option Glatt und geben Sie eine geeignete Zahl (z. B. 50) ein, um die Details der Oberfläche zu steuern. Wählen Sie Absolute Intensität unter Schwellenwert aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter .
      3. Passen Sie die Oberfläche an, bis sie das gesamte Gewebe bedeckt, und klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter . Klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter , um die Oberfläche zu erstellen.
   3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Auswahl , um die Oberfläche des gesamten Gewebes auszuwählen und das Volumen des Gewebes darzustellen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern , um Statistiken in eine Tabelle zu exportieren.

Ergebnisse

Diese Studie bietet eine einfache und effiziente Methode zur Markierung und Analyse der Glomeruli in Mäusenieren.

Glomeruli (Blutgefäße) können durch intravaskulär injiziertes FITC-Dextran gut markiert werden. Nach dem Reinigungsprozess wurde die Niere durchsichtig (Abbildung 1A), und die Glomeruli konnten mit Hilfe der Lichtblattmikroskopie (Abbildung 1B) oder der konfokalen Mikroskopie (Abbildung 1C

Diskussion

Tissue-Clearing-Technologien können in 3 oder 4 Gruppen eingeteilt^werden 29,30,31. Organisches Gewebe-Clearing auf Lösungsmittelbasis (z. B. DISCO und PEGASOS), Gewebe-Clearing auf wässriger Basis (z. B. CUBIC) und Hydrogel-einbettendes Gewebe-Clearing (z. B. CLARITY) wurden alle bei der Nierenreinigung angewendet 25,26,28,32.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% PFA	Biosharp	7007171800	Fixation reaagen
502 Glue	Deli	7146	For fixing the kidney to the sample fixing adapter
Antipyrine	Aladdin	A110660	Clearing reagent
Brain Matrix	RWD Life Science	1mm 40-75	Tissue slicing
Confocal microscopy	Nikon	A1plus	Image acquisition
FITC-Dextran	Sigma-Aldrich	FD150S	Labeling reagent
Light sheet fluorescence microscopy	Zeiss	Light sheet 7	Image acquisition
Mice	Ensiweier		Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g)
N-Butyldiethanolamine	Aladdin	B299095	Clearing reagent
Nicotinamide	Aladdin	N105042	Clearing reagent
Pentobarbital Natriumsalz	Sigma-Aldrich	P3761
Tail vein fixator	JINUOTAI	JNT-FS35	Fix the mouse for vail injection
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Clearing reagent