Erfassung der zytoskelettbasierten Agitation des Maus-Eizellkerns über räumliche Skalen hinweg

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet einen experimentellen Rahmen, um den physikalischen Einfluss des Zytoskeletts auf die Kernform und die inneren membranlosen Organellen im Eizellsystem der Maus zu dokumentieren. Das Framework kann für die Verwendung in anderen Zelltypen und Kontexten angepasst werden.

Zusammenfassung

Eine große Herausforderung beim Verständnis der Ursachen der weiblichen Unfruchtbarkeit besteht darin, die Mechanismen aufzuklären, die die Entwicklung weiblicher Keimzellen, der sogenannten Eizellen, steuern. Ihre Entwicklung ist durch Zellwachstum und anschließende Teilungen gekennzeichnet, zwei kritische Phasen, die die Eizelle auf die Fusion mit Spermien vorbereiten, um die Embryogenese einzuleiten. Während des Wachstums reorganisieren Eizellen ihr Zytoplasma, um den Zellkern im Zellzentrum zu positionieren, ein Ereignis, das die erfolgreiche Entwicklung der Eizellen bei Mäusen und Menschen und damit ihr embryogenes Potenzial vorhersagt. In Maus-Eizellen wurde gezeigt, dass diese zytoplasmatische Reorganisation durch das Zytoskelett angetrieben wird, dessen Aktivität mechanische Kräfte erzeugt, die den Zellkern bewegen, neu positionieren und durchdringen. Folglich stimmt diese Kraftübertragung von Zytoplasma zu Nukleoplasma die Dynamik von Kern-RNA-verarbeitenden Organellen, die als biomolekulare Kondensate bekannt sind, ab. Dieses Protokoll bietet einen experimentellen Rahmen, um mit hoher zeitlicher Auflösung den Einfluss des Zytoskeletts auf den Zellkern über räumliche Skalen in Maus-Eizellen zu dokumentieren. Es beschreibt die Bildgebungs- und Bildanalyseschritte und -werkzeuge, die erforderlich sind, um i) die Zytoskelettaktivität im Zytoplasma der Eizelle, ii) die auf dem Zytoskelett basierende Agitation des Eizellkerns und iii) ihre Auswirkungen auf die biomolekulare Kondensatdynamik im Eizellnukleoplasma zu bewerten. Über die Biologie der Eizellen hinaus können die hier entwickelten Methoden für den Einsatz in somatischen Zellen angepasst werden, um die auf dem Zytoskelett basierende Abstimmung der Kerndynamik über Skalen hinweg in ähnlicher Weise zu adressieren.

Einleitung

Die Kernpositionierung ist für mehrere Zell- und Entwicklungsfunktionen unerlässlich 1,2,3,4,5. Weibliche Keimzellen von Säugetieren, die Eizellen genannt werden, bauen ihr Zytoplasma um, um den Zellkern im Zellzentrum zu positionieren, obwohl sie eine asymmetrische Größenteilung durchlaufen, die auf einer nachfolgenden Chromosomen-Off-Centering beruht⁶ (Abbildung 1). Diese Zentrierung des Zellkerns sagt eine erfolgreiche Eizellenentwicklung bei Mäusen u....

Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Europäischen Gemeinschaft durchgeführt und vom französischen Landwirtschaftsministerium (Genehmigung Nr. 75-1170) und von der Direction Générale de la Recherche et de l'Innovation (DGRI; GVO-Vertragsnummer DUO-5291). Die Mäuse wurden in der Tieranlage in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus mit einer Umgebungstemperatur von 22-24 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 40%-50% untergebracht. Zu den hier verwendeten Mäusen gehören weibliche OF1 (Oncins France 1, 8 bis 12 Wochen alt) und weibliche C57BL/6 (10 bis 14 Wochen alt).

1. Eizellentnahme und -aufbereitung

Diskussion

Zu den wichtigsten Schritten in diesem Protokoll gehören die ordnungsgemäße Mikroinjektion von Eizellen, ohne ihr Überleben oder ihre normale Funktion zu beeinträchtigen ^9,10,11, sowie die Mikroinjektion vordefinierter Mengen an cRNA, die eine korrekte Visualisierung relevanter Strukturen wie Kernflecken ermöglichen würden.

Die Verbindung zwischen zytoplasmatischer und (intra-)nukleärer Dynami.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A3311
CSU-X1-M1 spinning disk	Yokogawa
DMI6000B microscope	Leica
Femtojet microinjector	Eppendorf
Fiji
Filter wheel	Sutter Instruments Roper Scientific
Fluorodish	World Precision Instruments	FD35-100
Metamorph software	Universal Imaging,		version 7.7.9.0
Mineral oil	Sigma Aldrich	M8410-1L
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
OF1 and C57BL/6 mice	Charles River Laboratories
Poly(A) Tailing kit	Thermo Fisher	AM1350
Retiga 3 CCD camera	QImaging
RNAeasy kit	Qiagen	74104
SC35 antibody	Abcam	ab11826	Nuclear speckle antibody; mouse IgG1 anti-SRSF2/SC35 (1:400)
SRSF2-GFP plasmid	OriGene Technologies	MG202528	NM_011358
Stripper Micropipette	XLAB Solutions		specialized for oocyte collection
T3 mMessage mMachine	Thermo Fisher	AM1384
T7 mMessage mMachine	Thermo Fisher	AM13344
Thermostatic chamber	Life Imaging Service
Windows Excel	Windows