In-vivo Kalzium-Bildgebung von sensorischen Neuronen im Trigeminusganglion der Ratte

Zusammenfassung

Genetisch kodierte Kalziumindikatoren (GECI) ermöglichen eine robuste Analyse der sensorischen Neuronensignalisierung auf Populationsebene. Hier haben wir einen neuartigen Ansatz entwickelt, der eine in vivo GECI-Visualisierung der Aktivität von Trigeminusganglien bei Ratten ermöglicht.

Zusammenfassung

Genetisch kodierte Kalziumindikatoren (GECIs) ermöglichen bildgebende Verfahren zur Überwachung von Veränderungen des intrazellulären Kalziums in Zielzellpopulationen. Ihr großes Signal-Rausch-Verhältnis macht GECIs zu einem leistungsstarken Werkzeug zur Erkennung reizevozierter Aktivität in sensorischen Neuronen. GECIs erleichtern die Analyse der Stimuluskodierung auf Populationsebene mit der Anzahl der Neuronen, die gleichzeitig untersucht werden können. Diese Populationskodierung erfolgt am besten in vivo. Die Spinalganglien (DRG), die das Soma von sensorischen Neuronen beherbergen, die somatische und viszerale Strukturen unterhalb des Halses innervieren, werden am häufigsten für die In-vivo-Bildgebung verwendet, da diese Strukturen relativ leicht zugänglich sind. In jüngerer Zeit wurde diese Technik bei Mäusen eingesetzt, um sensorische Neuronen im Trigeminusganglion (TG) zu untersuchen, die orale und kraniofaziale Strukturen innervieren. Es gibt viele Gründe, TG zusätzlich zur DRG zu untersuchen, einschließlich der langen Liste von Schmerzsyndromen, die spezifisch für orale und kraniofaziale Strukturen sind und Veränderungen in der sensorischen Neuronenaktivität widerzuspiegeln scheinen, wie z. B. Trigeminusneuralgie. Mäuse werden aufgrund der Verfügbarkeit genetischer Werkzeuge am häufigsten bei der Untersuchung von DRG- und TG-Neuronen verwendet. Aufgrund der Unterschiede in der Größe, der einfachen Handhabung und der potenziell wichtigen Speziesunterschiede gibt es jedoch Gründe, TG-Neuronen von Ratten und nicht von Mäusen zu untersuchen. Daher haben wir einen Ansatz für die Bildgebung von Ratten-TG-Neuronen in vivo entwickelt. Wir injizierten neonatalen Welpen (p2) intraperitoneal ein AAV, das GCaMP6s kodiert, was zu einer >90%igen Infektion von TG- und DRG-Neuronen führte. TG wurde beim Erwachsenen nach Kraniotomie und Dekortikation visualisiert, und Veränderungen der GCaMP6s-Fluoreszenz wurden in TG-Neuronen nach Stimulation von Unter- und Oberkieferregionen des Gesichts beobachtet. Wir bestätigten, dass Erhöhungen der Fluoreszenz durch eine periphere Nervenblockade stimuliert wurden. Obwohl dieser Ansatz viele potenzielle Anwendungen hat, verwenden wir ihn, um die Subpopulation(en) von TG-Neuronen zu charakterisieren, die nach einer peripheren Nervenverletzung verändert sind.

Einleitung

Somatosensibilität, die neuronale Kodierung mechanischer, thermischer und chemischer Reize, die auf die Haut oder andere Körperstrukturen, einschließlich Muskeln, Knochen und Eingeweide, einwirken, beginnt mit der Aktivität in primären afferenten Neuronen, die diese Strukturen innervieren¹. Elektrophysiologische Ansätze, die auf einer einzigen Einheit basieren, haben eine Fülle von Informationen über die afferenten Subtypen geliefert, die an diesem Prozess beteiligt sind, sowie darüber, wie sich ihre Reiz-Reaktions-Eigenschaften im Laufe der Zeit verändern können ^1,2,3. Während es jedoch nach wie vor starke Beweise für die Labeled-Line-Theorie gibt, die darauf hindeutet, dass spezifische sensorische Modalitäten durch bestimmte Subpopulationen von Neuronen vermittelt werden, deutet die Fähigkeit vieler Subpopulationen von Neuronen, auf die gleichen Arten von mechanischen, thermischen und chemischen Reizen zu reagieren, darauf hin, dass die Mehrheit der somatosensorischen Stimuli von mehreren Subpopulationen von Neuronen kodiert wird^{4. 5}. Anmelden Daher wird ein besseres Verständnis der Somatosensibilität nur mit der Fähigkeit kommen, die Aktivität von 10, wenn nicht Hunderten von Neuronen gleichzeitig zu untersuchen.

Fortschritte in optischen Ansätzen mit dem relativ neuen Aufkommen von konfokalen und später Multiphotonen- und digitalen Bildgebungstechniken haben es ermöglicht, relativ nicht-invasive Analysen der neuronalen Aktivität auf Populationsebene durchzuführen ^6,7. Eine der letzten Hürden bei der Anwendung dieser Technologie war die Entwicklung von Werkzeugen, die eine optische Beurteilung der neuronalen Aktivität ermöglichen. Angesichts der Geschwindigkeit eines Aktionspotentials, das in weniger als einer Millisekunde beginnen und enden kann, wäre ein spannungsempfindlicher Farbstoff mit der Fähigkeit, Änderungen des Membranpotentials mit der Geschwindigkeit eines Aktionspotentials zu verfolgen, das ideale Werkzeug für diesen Zweck. Doch obwohl es in diesem Bereich enorme Fortschritte gegeben hat 7,8,9,10, ist das Signal-Rausch-Verhältnis für viele dieser Farbstoffe immer noch nicht hoch genug, um eine Populationsanalyse von Hunderten von Neuronen auf Einzelzellebene zu ermöglichen. Als alternativen Ansatz haben sich die Forscher der Überwachung von Veränderungen der intrazellulären^Ca2+-Konzentration ([Ca²⁺]_i) zugewandt. Die Einschränkungen dieser Strategie waren von Anfang an klar und umfassen die Tatsache, dass ein Anstieg von [Ca²⁺]_i ein indirektes Maß für die neuronale Aktivität ist¹¹; dass ein Anstieg von [Ca²⁺]_i unabhängig vom Ca²⁺-Einstrom im Zusammenhang mit der Aktivierung von spannungsgesteuerten Ca²⁺-Kanälen (VGCCs) auftreten ^kann12,13; dass die Größe und Dauer eines^Ca2+-Transienten durch Prozesse gesteuert werden kann, die von der VGCC-Aktivität 11,12,14 unabhängig sind; und dass der zeitliche Verlauf von Ca2⁺-Transienten den eines Aktionspotentials¹⁵ bei weitem übersteigt. Nichtsdestotrotz gibt es eine Reihe von signifikanten Vorteilen, die mit der Verwendung von Ca²⁺ als indirektes Maß für die neuronale Aktivität verbunden sind. Nicht zuletzt ist dies das Signal-Rausch-Verhältnis, das mit den meisten Ca²⁺ Indikatoren verbunden ist und sowohl das Ausmaß der Änderung des intrazellulären Ca²⁺ als auch die Tatsache widerspiegelt, dass das Signal aus dem dreidimensionalen Raum des Zytosols und nicht aus dem zweidimensionalen Raum der Zellmembran stammt. Darüber hinaus ist es mit der Entwicklung genetisch kodierter Ca²⁺ Indikatoren (GECIs) möglich, genetische Strategien zu nutzen, um die Expression der Ca²⁺ Indikatoren in spezifischen Subpopulationen von Zellen zu steuern, was Analysen auf Populationsebene in intakten Präparaten erleichtert (siehe z. B.¹⁶).

Angesichts der Anzahl der genetischen Werkzeuge, die heute bei Mäusen zur Verfügung stehen, sollte es nicht überraschen, dass GECIs bei dieser Spezies am häufigsten verwendet wurden. Es wurden Mauslinien mit konstitutiver GECI-Expression in Subpopulationen sensorischer Neuronen entwickelt ^7,16,17. Mit der Entwicklung von Mauslinien, die Rekombinasen in bestimmten Zelltypen exprimieren, ist es möglich, noch ausgefeiltere Strategien zur Kontrolle der GECI-Expression^{zu verwenden 15}. Obwohl diese Werkzeuge immer leistungsfähiger werden, gibt es eine Reihe von Gründen, warum andere Spezies, wie z. B. Ratten, für einige experimentelle Fragen besser geeignet sein könnten. Dazu gehört die größere Größe, die eine Reihe von experimentellen Manipulationen ermöglicht, die bei der kleineren Maus schwierig, wenn nicht gar unmöglich sind; die Leichtigkeit, Ratten in relativ komplexen Verhaltensaufgaben zu trainieren; und zumindest einige Hinweise darauf, dass die biophysikalischen Eigenschaften und Expressionsmuster mehrerer Ionenkanäle in sensorischen Neuronen von Ratten denen ähnlicher sein könnten, die in menschlichen sensorischen Neuronen beobachtet wurden, als die gleichen Kanäle in der Maus im Vergleich zum Menschen¹⁸.

Während die Transduktion somatosensorischer Reize im Allgemeinen in den peripheren Endigungen primärer Afferenzen stattfindet, muss das in der Peripherie initiierte Aktionspotential die Struktur passieren, in der sich primäre afferente Somata befinden, die als dorsale Wurzel (DRG) oder trigeminale (TG) Ganglien bezeichnet wird, bevor es das zentrale Nervensystem erreicht¹⁹. Während es Hinweise darauf gibt, dass nicht jedes Aktionspotential, das sich entlang eines primären afferenten Axons ausbreitet, in den Zellkörper²⁰ eindringt, eine Folge der Tatsache, dass die primären afferenten Somata über einen T-Übergang¹⁹ mit dem afferenten Hauptaxon verbunden sind, scheint die Mehrzahl der in der Peripherie initiierten Aktionspotentiale in das Soma²¹ einzudringen. Dies verleiht drei experimentelle Vorteile bei der Verwendung von GECIs zur Bewertung der Populationskodierung in primären Afferenzen: Die große Größe des Zellkörpers im Verhältnis zu den Axonen erhöht das Signal-Rausch-Verhältnis weiter, wenn [Ca²⁺]_i als indirektes Maß für die afferente Aktivität verwendet wird; die DRG sind in der Regel leicht zugänglich; Und die Beurteilung der Aktivität an einer Stelle, die räumlich von den afferenten Endigungen entfernt ist, minimiert die potenziellen Auswirkungen der Operation, die erforderlich ist, um die Ganglien freizulegen, auf die Reiz-Reaktions-Eigenschaften der afferenten Terminals. Da sich TG jedoch unter dem Gehirn (oder oberhalb der Palette) befinden, sind sie weitaus schwieriger zugänglich als DRG. Darüber hinaus gibt es zwar viele Ähnlichkeiten zwischen DRG- und TG-Neuronen, aber auch eine wachsende Liste von Unterschieden. Dazu gehören die annähernd somatotope Organisation der Neuronen in der TG²², einzigartige innervierte Strukturen, unterschiedliche zentrale terminale Terminationsmuster 23,24,25,26 und nun eine wachsende Liste von Unterschieden sowohl in der Genexpression^27,28 als auch in der funktionellen Rezeptorexpression²⁹. Da wir an der Identifizierung peripherer Schmerzmechanismen interessiert sind, deutet die relativ große Anzahl von Schmerzsyndromen, die für das Trigeminussystem einzigartig zu sein scheinen (z. B. Migräne, Trigeminusneuralgie, Burning-Mouth-Syndrom), die eine aberrante Aktivität in primären Afferenzen zu beinhalten scheinen 30,31,32, darauf hin, dass die TG direkt untersucht werden muss.

Während also die Stimulus-Reaktions-Eigenschaften von TG-Neuronen mit GECIs in der Maus untersucht wurden¹⁶, da die oben aufgeführten Gründe darauf hindeuten, dass die Ratte eine geeignetere Spezies sein könnte, um eine Vielzahl von experimentellen Fragen zu beantworten, bestand das Ziel der vorliegenden Studie darin, einen Ansatz zur Verwendung von GECIs zur Untersuchung von TG-Neuronen in der Ratte zu entwickeln. Um dies zu erreichen, haben wir einen viralen Ansatz verwendet, um die Expression der GECI GCaMP6s im peripheren Nervensystem zu steuern. Dann haben wir das Vorderhirn entfernt, um den Zugang zum TG zu ermöglichen. Abschließend wurden mechanische und thermische Reize auf das Gesicht aufgebracht, während neuronale Reaktionen unter Fluoreszenzmikroskopie beurteilt wurden. Zusammengenommen unterstützen diese Daten die Rolle der Ratte zur Untersuchung von Veränderungen in der TG unter vielen Zuständen und erweitern das Instrumentarium für Forscher, die sich für sensorische Kodierung im Trigeminussystem interessieren.

Protokoll

Alle Experimente, bei denen Tiere in der Forschung verwendet wurden, wurden in Übereinstimmung mit den Standards der National Institutes of Health und der International Association for the Study of Pain durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Pittsburgh genehmigt (Protokoll #22051100). Am Ende jedes Experiments wurden die Ratten durch Exanguination mit kardialer Perfusion von eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) euthanasiert, ein Ansatz, der von der American Veterinary Medical Association und der University of Pittsburgh IACUC genehmigt wurde.

1. GCaMP-Induktion

1. Bestellen Sie zeitträchtige Sprague Dawley-Ratten, damit die Welpen zum richtigen Zeitpunkt nach der Geburt injiziert werden können.
2. Besprühen Sie die Handschuhe mit 70% EtOH, bevor Sie jeden Rattenwelpen anfassen. Dies wird den Damm davon abhalten, die Jungen zu kannibalisieren.
3. Rattenbabys (P1-2) mit 70% EtOH abtupfen und 3 Minuten auf Eis anästhesieren.
4. Injizieren Sie 15 μl AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40 (Addgene) intraperitoneal mit einer sterilen, gasdichten 25-μl-Hamilton-Spritze.

2. Trigeminusganglien-Expositionsoperation

1. Anästhesiecocktail (55 mg/kg Ketamin, 5,5 mg/kg Xylazin, 1 mg/kg Acepromazin) intraperitoneal basierend auf dem Körpergewicht an 6-8 Wochen alte Ratten (ca. 150-200 g) verabreichen.
   HINWEIS: Dies ist im Allgemeinen ausreichend, um eine chirurgische Anästhesieebene aufrechtzuerhalten, die durch das Fehlen eines Rückzugsreflexes auf schädliches Einklemmen einer Hinterpfote beurteilt wird. Ergänzen Sie jedoch mit Isofluran über einen Nasenkegel, wenn die Tiere leicht werden.
2. Sobald Sie vollständig betäubt sind, rasieren Sie die Haare und Schnurrhaare des Kopfes und des Gesichts.
3. Montieren Sie die Ratte an einem stereotaktischen Rahmen mit Ohrbügeln und legen Sie ein Heizkissen (~37 ^°C) darunter, um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten.
4. Überwachen Sie die Vitalparameter (Herzfrequenz, Atemfrequenz, Blutsauerstoffsättigung) mit einem Mausoximeter oder vergleichbar.
   HINWEIS: Die Körpertemperatur wird von einer Rektalsonde überwacht und aufrechterhalten, indem Ratten auf eine rückkopplungsgesteuerte zirkulierende Wasserdecke gelegt werden.
5. Geben Sie in eiskalte Kochsalzlösung getauchte Gaze auf den Kopf, um die Blutgefäße zu verengen und Blutungen zu minimieren. Machen Sie mit einem Skalpell der Größe 15 einen Mittellinienschnitt der Haut und des Muskels über dem Schädel.
6. Verwende eine stumpfe Dissektion der Haut und der Muskeln, um den Schädel freizulegen.
7. Perforieren Sie mit einem 1/4 runden Bohrer vorsichtig die Schädeldecke, um das Vorderhirn freizulegen. Schneiden Sie dann mit Rongeuren (2,5 mm Körbchen) vorsichtig durch den Schädel.
8. Machen Sie mit einem Skalpell der Größe 15 einen Schnitt in das Gehirn (Bregma: -3,80) und den Riechkolben.
   HINWEIS: Wenn Sie über diesen Punkt hinaus weiter kaudal schneiden, führt dies zum Tod der Ratte
9. Verwenden Sie einen Spatel, um die Dura vorsichtig vom Schädel zu trennen und heben Sie das abgetrennte Gehirn vorsichtig an, um den TG und die Schädelbasis freizulegen.
   HINWEIS: Die zusätzliche Verwendung von eiskalter Kochsalzperfusion während der gesamten Extraktion minimiert Blutungen und optimiert das folgende Dissektionsfeld.
10. Mit einem Kauterstift die durch die Extraktion entstandenen Blutungen stillen.
    HINWEIS: Das Durchtrennen der Dura führt zu unvermeidlichen Blutungen. Es ist am besten, eiskaltes aCSF (119 mM NaCl, 26,2 mM NaHCO₃, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH₂PO₄, 1,3 mM MgCl₂, 10 mM Glukose, 2,5 mM CaCl₂) zuzubereiten, um die Schädelhöhle zu baden, um die Blutgefäße zu verengen und gleichzeitig die neuronale Gesundheit zu erhalten.

3. GCaMP6s-Bildgebung

HINWEIS: Angesichts der Größe und Dichte dieser Neuronen bestimmt das verwendete Bildgebungs- und Datenerfassungssystem (Objektiv, Mikroskop, Lichtquelle, Kamera) die Anzahl der visualisierten GECI⁺ -Zellen. Die Lichtquelle, das Objektiv und die Kamera bestimmen auch die Parameter, die für die Bildaufnahme verwendet werden, einschließlich Belichtungszeit und Bildaufnahmerate. Während Multiphotonen- und konfokale Techniken je nach den Parametern des Experiments verwendet werden können, kann die Epifluoreszenzmikroskopie ausreichen, um viele Zellen aufzulösen. Es kann jedes Bildaufnahmepaket verwendet werden. Im Idealfall ist die Stimulusapplikation mit dem Bildaufnahme-Softwarepaket zeitlich fixiert.

1. Platzieren Sie die Schädelhöhle unter dem Objektiv und bringen Sie die TG mit sichtbarem Licht in den Fokus.
2. Die Anregungswellenlänge von GCaMP6s beträgt 496 nm und die Emissionswellenlänge 513 nm. Verwenden Sie daher die entsprechenden dichroitischen und Filterwürfel, um GCaMP⁺ -Zellen zu lokalisieren. Passen Sie den Fokus an, um den Bereich der Ganglien zu lokalisieren und aufzulösen, in dem Neuronen auf Reize reagieren, die auf das empfängliche Feld von Interesse angewendet werden.
3. Verwenden Sie ein 10-faches Objektiv, um Visualisierungen der meisten Neuronen in der TG zu ermöglichen, die auf mechanische Reize reagieren, die auf eine 1 cm² große Region des Gesichts¹⁶ angewendet werden. Verwenden Sie ein 20-fach trockenes Objektiv mit einem großen Arbeitsabstand (10,8 mm), um die Auflösung zu erhöhen.
4. Verwenden Sie Erfassungssoftware (z. B. Metamorph), um Fluoreszenzdaten über die Zeit und als Reaktion auf die Anwendung von Reizen zu sammeln.
   1. Um das Ausbleichen der Neuronen zu minimieren, verwenden Sie eine möglichst kurze Belichtungszeit, um einen Ausgangswert und einen evozierten Anstieg der Fluoreszenz zu erkennen. Mit dem 20x-Luftobjektiv mit 0,40 NA, einer 120-W-Quecksilberhalogenid-Lichtquelle und einer komplementären Metalloxid-Halbleiter-Kamera (CMOS), die in der vorliegenden Studie verwendet wurden, erhalten Sie mit einer Belichtungszeit von 300 ms und einer Bildaufnahmerate von 3 Hz stabile Basislinienaufnahmen für >90 Minuten.
      HINWEIS: 1) Diese Bildaufnahmeparameter müssen empirisch bestimmt werden. 2) Mechanische (Pinsel, Punkt, Vibration, Kneifen), thermische (Hitze und Kälte) und chemische (Capsaicin, Menthol, Entzündungsmediatoren) können auf das rezeptive Feld aufgetragen werden. Ein relativ kostengünstiger subjektiver Ansatz ist es, die Reize von Hand anzuwenden. Es werden jedoch objektivere und reproduzierbarere Ansätze empfohlen, bei denen rückkopplungsgesteuerte Aktuatoren für die wiederholte Anwendung bei bekannter Kraft verwendet werden können. Während rückkopplungsgesteuerte Peltier-Geräte für kontrolliertes Heizen und Kühlen nützlich sind, sind sie nicht ideal für die thermische Stimulation einer gekrümmten Fläche. Rückkopplungsgesteuerte Infrarot-Lichtquellen sind eine Alternative zum Heizen, und Kaltspritzen ist eine nicht gerade ideale Alternative zur Kühlung.

Ergebnisse

Da wir bereits mit dem AAV9-Serotyp für die Infektion von sensorischen Neuronen der Ratte erfolgreich waren¹⁵, haben wir diesen Serotyp für die Expression von GCaMP6s in TG-Neuronen der Ratte verwendet. Wir versuchten daher zunächst, die Effizienz der sensorischen Neuroneninfektion von AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40 (AAV9-GCaMP) zu untersuchen, als dieses Virus an neugeborene Rattenjungtiere verabreicht wurde²⁰. Dieses Virus nutzt den CAG-Promotor, der eine hohe Genexpressio...

Diskussion

Hier demonstrieren wir eine schnelle, nicht-invasive Methode zur Generierung einer GECI-Ratte für die Bildgebung der TG. Wir haben uns für einen CAG-Promotor entschieden, um ein hohes Maß an Genexpression zu fördern und aufrechtzuerhalten. Während frühere Studien darauf hindeuten, dass andere AAV-Serotypen die Genexpression in DRG-Neuronen effizient steuern können³⁹, stimmen unsere Ergebnisse mit einer kürzlich durchgeführten Studie überein, in der intraperitoneale Injektion von AAV bei ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40	Addgene	100844-AAV9	AAV9-GCaMP6s virus
ACEpromazine maleate	Covetrus	11695-0095-5	10 mg/mL
AnaSed (Xylazine) injection	AKORN Animal Health	23076-35-9	20 mg/mL
CTR5500 Electronics box	Leica	11 888 820	Power Supply
Cutwell burr drill bit	Ransom & Randolph		¼ round
DM 6000 FS	Leica	11 888 928	Base Stand
EL6000	Leica	EL6000	Light source with 120 W mercury bulb
Forceps	FST	11252-00	Dumont No. 05
Friedman rongeurs	FST	16000-14	2.5 mm cup size
Friedman-Pearson rongeurs	FST	16021-14	1 mm cup size
Heating pad (Temperature therapy pad)	STRYKER	8002-062-022
Ketamine hydrochloride	Covetrus	1695-0703-1	100 mg/mL
Plan Fluor 20x/0.40	Leica	MRH00105	20x objective, 0.4 NA10.8 mm WD
Power handle high-temp cautery pen	Bovie	HIT1	handheld Change-A-Tip cautery pen
Prime 95B	Photometrics	Prime 95B	CMOS Camera
Saline	Fisher Scientific	NC0291799	0.9% Sterile Saline
Scalpel blade	Fisher Scientific	22-079-701	size 15 disposable blade
Spatula	BRI	48-1460	brain spatula
Spring scissors	FST	91500-09	Student Vannas, 5 mm cutting edge
Spring scissors	FST	15012-12	Noyes, 14 mm cutting edge
STP6000 Smart touch panel	Leica	11 501 255	Control Panel
Syringe	Hamilton	80201	25 μL Model 1702 Luer Tip syringe
Water heater	Adroit	HTP-1500