In-vivo Kalzium-Bildgebung von sensorischen Neuronen im Trigeminusganglion der Ratte

Zusammenfassung

Genetisch kodierte Kalziumindikatoren (GECI) ermöglichen eine robuste Analyse der sensorischen Neuronensignalisierung auf Populationsebene. Hier haben wir einen neuartigen Ansatz entwickelt, der eine in vivo GECI-Visualisierung der Aktivität von Trigeminusganglien bei Ratten ermöglicht.

Zusammenfassung

Genetisch kodierte Kalziumindikatoren (GECIs) ermöglichen bildgebende Verfahren zur Überwachung von Veränderungen des intrazellulären Kalziums in Zielzellpopulationen. Ihr großes Signal-Rausch-Verhältnis macht GECIs zu einem leistungsstarken Werkzeug zur Erkennung reizevozierter Aktivität in sensorischen Neuronen. GECIs erleichtern die Analyse der Stimuluskodierung auf Populationsebene mit der Anzahl der Neuronen, die gleichzeitig untersucht werden können. Diese Populationskodierung erfolgt am besten in vivo. Die Spinalganglien (DRG), die das Soma von sensorischen Neuronen beherbergen, die somatische und viszerale Strukturen unterhalb des Halses innervieren, werden am häufigsten für die In-vivo-Bildgebung verwendet, da diese Strukturen relativ leicht zugänglich sind. In jüngerer Zeit wurde diese Technik bei Mäusen eingesetzt, um sensorische Neuronen im Trigeminusganglion (TG) zu untersuchen, die orale und kraniofaziale Strukturen innervieren. Es gibt viele Gründe, TG zusätzlich zur DRG zu untersuchen, einschließlich der langen Liste von Schmerzsyndromen, die spezifisch für orale und kraniofaziale Strukturen sind und Veränderungen in der sensorischen Neuronenaktivität widerzuspiegeln scheinen, wie z. B. Trigeminusneuralgie. Mäuse werden aufgrund der Verfügbarkeit genetischer Werkzeuge am häufigsten bei der Untersuchung von DRG- und TG-Neuronen verwendet. Aufgrund der Unterschiede in der Größe, der einfachen Handhabung und der potenziell wichtigen Speziesunterschiede gibt es jedoch Gründe, TG-Neuronen von Ratten und nicht von Mäusen zu untersuchen. Daher haben wir einen Ansatz für die Bildgebung von Ratten-TG-Neuronen in vivo entwickelt. Wir injizierten neonatalen Welpen (p2) intraperitoneal ein AAV, das GCaMP6s kodiert, was zu einer >90%igen Infektion von TG- und DRG-Neuronen führte. TG wurde beim Erwachsenen nach Kraniotomie und Dekortikation visualisiert, und Veränderungen der GCaMP6s-Fluoreszenz wurden in TG-Neuronen nach Stimulation von Unter- und Oberkieferregionen des Gesichts beobachtet. Wir bestätigten, dass Erhöhungen der Fluoreszenz durch eine periphere Nervenblockade stimuliert wurden. Obwohl dieser Ansatz viele potenzielle Anwendungen hat, verwenden wir ihn, um die Subpopulation(en) von TG-Neuronen zu charakterisieren, die nach einer peripheren Nervenverletzung verändert sind.

Einleitung

Somatosensibilität, die neuronale Kodierung mechanischer, thermischer und chemischer Reize, die auf die Haut oder andere Körperstrukturen, einschließlich Muskeln, Knochen und Eingeweide, einwirken, beginnt mit der Aktivität in primären afferenten Neuronen, die diese Strukturen innervieren¹. Elektrophysiologische Ansätze, die auf einer einzigen Einheit basieren, haben eine Fülle von Informationen über die afferenten Subtypen geliefert, die an diesem Prozess beteiligt sind, sowie darüber, wie sich ihre Reiz-Reaktions-Eigenschaften im Laufe der Zeit verändern können ^1,2,3

Protokoll

Alle Experimente, bei denen Tiere in der Forschung verwendet wurden, wurden in Übereinstimmung mit den Standards der National Institutes of Health und der International Association for the Study of Pain durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Pittsburgh genehmigt (Protokoll #22051100). Am Ende jedes Experiments wurden die Ratten durch Exanguination mit kardialer Perfusion von eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) euthanasiert, ein Ansatz, der von der American Veterinary Medical Association und der University of Pittsburgh IACUC genehmigt wurde.

1. GCaMP-Induktion

Diskussion

Hier demonstrieren wir eine schnelle, nicht-invasive Methode zur Generierung einer GECI-Ratte für die Bildgebung der TG. Wir haben uns für einen CAG-Promotor entschieden, um ein hohes Maß an Genexpression zu fördern und aufrechtzuerhalten. Während frühere Studien darauf hindeuten, dass andere AAV-Serotypen die Genexpression in DRG-Neuronen effizient steuern können³⁹, stimmen unsere Ergebnisse mit einer kürzlich durchgeführten Studie überein, in der intraperitoneale Injektion von AAV bei .......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40	Addgene	100844-AAV9	AAV9-GCaMP6s virus
ACEpromazine maleate	Covetrus	11695-0095-5	10 mg/mL
AnaSed (Xylazine) injection	AKORN Animal Health	23076-35-9	20 mg/mL
CTR5500 Electronics box	Leica	11 888 820	Power Supply
Cutwell burr drill bit	Ransom & Randolph		¼ round
DM 6000 FS	Leica	11 888 928	Base Stand
EL6000	Leica	EL6000	Light source with 120 W mercury bulb
Forceps	FST	11252-00	Dumont No. 05
Friedman rongeurs	FST	16000-14	2.5 mm cup size
Friedman-Pearson rongeurs	FST	16021-14	1 mm cup size
Heating pad (Temperature therapy pad)	STRYKER	8002-062-022
Ketamine hydrochloride	Covetrus	1695-0703-1	100 mg/mL
Plan Fluor 20x/0.40	Leica	MRH00105	20x objective, 0.4 NA10.8 mm WD
Power handle high-temp cautery pen	Bovie	HIT1	handheld Change-A-Tip cautery pen
Prime 95B	Photometrics	Prime 95B	CMOS Camera
Saline	Fisher Scientific	NC0291799	0.9% Sterile Saline
Scalpel blade	Fisher Scientific	22-079-701	size 15 disposable blade
Spatula	BRI	48-1460	brain spatula
Spring scissors	FST	91500-09	Student Vannas, 5 mm cutting edge
Spring scissors	FST	15012-12	Noyes, 14 mm cutting edge
STP6000 Smart touch panel	Leica	11 501 255	Control Panel
Syringe	Hamilton	80201	25 μL Model 1702 Luer Tip syringe
Water heater	Adroit	HTP-1500