Qualitative und quantitative Analyse der Siderophorproduktion aus Pseudomonas aeruginosa

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet sowohl qualitative als auch quantitative Analysen von Gesamtsiderophoren, Pyoverdin und Pyochelin aus Pseudomonas aeruginosa.

Zusammenfassung

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) ist dafür bekannt, dass er eine Vielzahl von Virulenzfaktoren produziert, um Infektionen im Wirt zu etablieren. Ein solcher Mechanismus ist das Abfangen von Eisen durch Siderophorproduktion. P. aeruginosa produziert zwei verschiedene Siderophore: Pyochelin, das eine geringere Eisenchelat-Affinität aufweist, und Pyoverdin, das eine höhere Eisenchelat-Affinität aufweist. Dieser Bericht zeigt, dass Pyoverdin direkt aus bakteriellen Überständen quantifiziert werden kann, während Pyochelin vor der Quantifizierung aus Überständen extrahiert werden muss.

Die primäre Methode zur qualitativen Analyse der Siderophorproduktion ist der Chrom-Azurolsulfonat-Agarplatten-Assay (CAS). In diesem Assay führt die Freisetzung des CAS-Farbstoffs aus dem^Fe3+-Farbstoffkomplex zu einem Farbwechsel von Blau zu Orange, was auf eine Siderophorproduktion hinweist. Für die Quantifizierung der gesamten Siderophore wurden bakterielle Überstände zu gleichen Teilen mit CAS-Farbstoff in einer Mikrotiterplatte gemischt, gefolgt von einer spektrophotometrischen Analyse bei 630 nm. Pyoverdin wurde direkt aus dem bakteriellen Überstand quantifiziert, indem es zu gleichen Teilen mit 50 mM Tris-HCl gemischt wurde, gefolgt von einer spektrophotometrischen Analyse. Ein Peak bei 380 nm bestätigte das Vorhandensein von Pyoverdin. Was Pyochelin betrifft, so war eine direkte Quantifizierung aus dem bakteriellen Überstand nicht möglich, so dass es zuerst extrahiert werden musste. Die anschließende spektrophotometrische Analyse ergab das Vorhandensein von Pyochelin mit einem Peak bei 313 nm.

Einleitung

Organismen benötigen Eisen, um verschiedene lebenswichtige Funktionen zu erfüllen, wie z. B. den Elektronentransport und die DNA-Replikation¹. Es ist bekannt, dass Pseudomonas aeruginosa, ein gramnegativer opportunistischer Erreger, eine Vielzahl von Virulenzfaktoren besitzt, um eine Infektion im Wirt zu etablieren, von denen ein Mechanismus die Siderophorbildung^{ist 2}. Unter eisenabbauenden Bedingungen setzt P. aeruginosa spezialisierte Moleküle frei, die als Siderophore bezeichnet werden und Eisen aus der Umgebung abschrecken. Siderophore chelatieren Eisen extrazellulär, und der resultierende Eisen-Sid....

Protokoll

Alle Bakterienisolate von P. aeruginosa wurden aus medizinischen mikrobiologischen Labors in Vadodara und Jaipur, Indien, bezogen. Alle ausgewählten klinischen Isolate wurden in der Biosicherheitswerkbank (BSL2) gehandhabt und beim Umgang mit Bakterienisolaten während der Experimente wurde äußerste Sorgfalt walten lassen. Die kommerziellen Details aller Reagenzien/Lösungen sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Herstellung von Chrom-Azurolsulfonat (CAS)-Farbstoff und Agar-Agar-Medien

1. CAS-Farbstoff (100 ml) mit der folgenden Zusammensetzung herstellen:
   1. 60 mg CAS werden in 50 ml destilliertem Was....

Diskussion

Dieses Protokoll ermöglicht es den Forschern, die Gesamtzahl der Siderophore und zwei verschiedene Siderophore von P. aeruginosa, nämlich Pyoverdin und Pyochelin, aus dem bakteriellen zellfreien Überstand zu quantifizieren. Im CAS-Agarplatten-Assay bilden der CAS-Farbstoff und^Fe3+-Ionen einen Komplex. Wenn Bakterien Siderophore produzieren, löschen sie^Fe-3+-Ionen aus dem CAS-Fe3⁺-Komplex, was zu einer Farbänderung um das Bakterienwachstum herum führt. Diese Veränderung fü.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar Agar, Type I	HIMEDIA	GRM666
8-Hydroxyquinoline	Loba Chemie	4151
Casamino Acid	SRL Chemicals	68806
Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB)	HIMEDIA	RM4867-100G
Chloroform	Merck	1070242521
Chrome azurol sulfonate	HIMEDIA	RM336-10G
Citric acid	Merck	100241
Dextrose monohydrate	Merck	108342
Dichloromethane	Merck	107020
Ferric chloride hexahydrate	HIMEDIA	GRM6353
Glass Flasks	Borosil	5100021
Glass Test-tubes	Borosil	9820U05
Hydrochloric acid	SDFCL	20125
King's medium B base	HIMEDIA	M1544-500G
M9 Minimal Medium Salts	HIMEDIA	G013-500G
Magnesium Sulphate	Qualigens	10034
MultiskanGO UV Spectrophotometer	Thermo Scientific	51119200
Peptone Type I, Bacteriological	HIMEDIA	RM667-500G
PIPES free acid	MP Biomedicals	190257
Potassium dihydrogen phosphate	Merck	1048731000
Proteose peptone	HIMEDIA	RM005-500G
Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer	Shimadzu	2072310058
Sigma Laborzentrifuge	Sigma-Aldrich	3-18K
Sodium chloride	Qualigens	15915