Abschätzung der strukturellen Empfindlichkeit von intrinsisch ungeordneten Regionen als Reaktion auf hyperosmotischen Stress in lebenden Zellen mit FRET

Zusammenfassung

Intrinsisch ungeordnete Regionen (IDRs) sind flexible Proteindomänen, die ihre Konformation als Reaktion auf Umweltveränderungen verändern. Der Ensemble-Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) kann Proteindimensionen unter verschiedenen Bedingungen abschätzen. Wir präsentieren einen FRET-Ansatz zur Bewertung der strukturellen IDR-Sensitivität in lebenden Saccharomyces cerevisiae-Zellen unter hyperosmotischem Stress.

Zusammenfassung

Intrinsisch ungeordnete Regionen (IDRs) sind Proteindomänen, die an entscheidenden zellulären Prozessen beteiligt sind. Unter Stressbedingungen ändern sich die physikalisch-chemischen Eigenschaften der zellulären Umgebung, was sich direkt auf das Konformationsensemble der IDRs auswirkt. IDRs reagieren von Natur aus empfindlich auf Umweltstörungen. Die Untersuchung, wie die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Zelle das Konformationsensemble von IDRs regulieren, ist für das Verständnis der Umweltkontrolle ihrer Funktion unerlässlich. Hier beschreiben wir eine schrittweise Methode zur Messung der strukturellen Sensitivität von IDRs in lebenden Saccharomyces cerevisiae-Zellen als Reaktion auf hyperosmotische Stressbedingungen. Wir stellen die Verwendung des Ensemble-Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfers (FRET) vor, um abzuschätzen, wie sich die globalen Dimensionen von IDRs während eines fortschreitenden Anstiegs des hyperosmotischen Stresses ändern, der Zellen mit einem beliebigen Osmolyten auferlegt wird. Darüber hinaus stellen wir ein Skript zur Verarbeitung von Fluoreszenzmessungen und zum Vergleich der strukturellen Empfindlichkeit für verschiedene IDRs zur Verfügung. Durch diese Methode können Forscher wertvolle Einblicke in die Konformationsänderungen gewinnen, die IDRs im komplexen intrazellulären Milieu bei wechselnden Umgebungen erfahren.

Einleitung

Intrinsisch ungeordnete Regionen (IDRs) sind kritische Komponenten in zellulären Prozessen¹. In Kombination mit strukturierten Domänen sind IDRs essentiell für Proteinfunktionen. Die Aminosäurezusammensetzung von IDRs ist verzerrt und wird hauptsächlich durch geladene, hydrophile und kleine Reste dargestellt. Aufgrund dieser Eigenschaft werden IDRs als Domänen mit geringer Komplexität betrachtet ^2,3. Zahlreiche IDRs haben Aufmerksamkeit erregt, vor allem, weil diese Regionen eine entscheidende Rolle bei pathologischen Zuständen spielen, insbesondere bei neurodegenerativen Erkrankungen. ....

Protokoll

1. Plasmid-Konstrukt

1. Amplifizieren Sie den offenen Leserahmen (ORF), der für die gewünschte IDR kodiert, durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Schließen Sie das Stoppcodon nicht ein, da der ORF von den Genen flankiert wird, die für die fluoreszierenden Proteine kodieren. Für die Amplifikation werden Primer mit den Restriktionsstellen SacI (5') und BglII (3') entworfen.
   HINWEIS: Für den Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" haben wir AtLEA4-5 als ausgewählten IDR verwendet. Wir haben den ORF von AtLEA4-5 aus dem pTrc99A-AtLEA4-5-Plasmid¹² amplifiziert.
2. Das ORF-PCR-Produkt wird durch kons....

Diskussion

Die hier vorgestellte Methode bietet eine Möglichkeit, Einblicke zu gewinnen, wie die globalen Dimensionen des Ensembles von IDRs Umweltstörungen wahrnehmen und darauf reagieren. Diese Methode beruht auf einem genetisch kodierten Konstrukt und benötigt keine zusätzlichen Komponenten außer einer plasmidstabilen Expression in Hefezellen, wodurch sie für potenzielle Anwendungen in anderen Zelltypen angepasst werden kann. Darüber hinaus ist es vielseitig einsetzbar, um andere physikalisch-chemische Störungen zu erfor.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plate	Greiner Bio-One	655096
Agar	Sigma-Aldrich	5040
BglII	New England BioLabs	R0144S
BJ5465 cells	American Type Culture Collection	208289
Buffer MES 50 mM	Sigma-Aldrich	M8250
Buffer Tris-HCl 10 mM	Invitrogen	15506017
EDTA 1 mM	Merck	108452
Falcon tubes	Corning	352057
LB media	Sigma-Aldrich	L2897
Lithium acetate 0.1 M	Sigma-Aldrich	L6883
Low Melt Agarose	GOLDBIO	A-204-25
Microcentrifuge	eppendorf	5452000010
Miniprep kit	ZymoPure	D4210
NaOH 0.02 M	Merck	106462
PEG 3,350 40%	Sigma-Aldrich	1546547
plasmid pDRFLIP38-AtLEA4-5	addgene	178189
Plate reader	BMG LABTECH	CLARIOstar Plus
SacI	New England BioLabs	R3156S
Salmon sperm DNA 2 mg/mL	Thermo Fisher Scientific	15632011
SD-Ura	Sigma-Aldrich	Y1501
Sodium cloride	Sigma-Aldrich	S9888
Taq polymesare	Promega	M5123
Transiluminator	Accuris instruments	E4000
UV-Visible spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	Biomate3
YPD media	Sigma-Aldrich	Y1500