Charakterisierung von Multidrug-Efflux-Systemen in Acinetobacter baumannii unter Verwendung eines Efflux-defizienten Bakterienstamms und eines Single-Copy-Genexpressionssystems

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein einfaches Verfahren zur chromosomalen Einzelkopie-Komplementierung eines Efflux-Pumpengens unter Verwendung eines mini-Tn7-basierten Expressionssystems in einen gentechnisch veränderten Efflux-defizienten Stamm von Acinetobacter baumannii. Dieses präzise genetische Werkzeug ermöglicht eine kontrollierte Genexpression, die für die Charakterisierung von Effluxpumpen in multiresistenten Krankheitserregern von entscheidender Bedeutung ist.

Zusammenfassung

Acinetobacter baumannii ist aufgrund seiner weit verbreiteten Resistenz gegen Antibiotika als anspruchsvoller gramnegativer Erreger anerkannt. Es ist entscheidend, die Mechanismen hinter dieser Resistenz zu verstehen, um neue und wirksame Therapieoptionen zu entwickeln. Leider wird unsere Fähigkeit, diese Mechanismen bei A. baumannii zu untersuchen, durch den Mangel an geeigneten Genmanipulationswerkzeugen behindert. Hier beschreiben wir Methoden zur Verwendung eines chromosomalen mini-Tn7-basierten Systems, um eine Einzelkopie-Genexpression in einem A. baumannii-Stamm zu erreichen, dem funktionelle RND-Typ-Efflux-Mechanismen fehlen. Einzelkopieninsertion und induzierbare Effluxpumpenexpression sind sehr vorteilhaft, da das Vorhandensein von RND-Efflux-Operonen auf Plasmiden mit hoher Kopienzahl von Bakterienzellen oft schlecht vertragen wird. Darüber hinaus hilft der Einbau rekombinanter mini-Tn7-Expressionsvektoren in das Chromosom eines Surrogat-A . baumannii-Wirts mit erhöhter Effluxempfindlichkeit, Interferenzen durch andere Effluxpumpen zu umgehen. Dieses System ist nicht nur für die Untersuchung uncharakterisierter bakterieller Effluxpumpen wertvoll, sondern auch für die Bewertung der Wirksamkeit potenzieller Inhibitoren, die auf diese Pumpen abzielen.

Einleitung

Acinetobacter baumannii ist aufgrund seiner umfassenden Resistenz gegen alle Klassen von Antibiotika ein Krankheitserreger der Weltgesundheitsorganisation mit höchster Priorität¹. Es ist ein opportunistischer Erreger, der hauptsächlich hospitalisierte, verletzte oder immungeschwächte Menschen betrifft. A. baumannii entzieht sich Antibiotika weitgehend über Effluxpumpen, wobei die relevanteste die Exporteursfamilie der Resistance-Nodulation-Division (RND)^{ist 2}. Wenn man versteht, wie diese Effluxpumpen mechanistisch funktionieren, kann man gezielte therapeutische Optionen entwickeln.

Protokoll

1. Experimentelle Vorbereitung

1. Reinigen Sie das Plasmid pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm⁹ (Insertionsplasmid, Abbildung 2A) mit dem interessierenden Gen.
   HINWEIS: Hier ist das interessierende Gen adeIJK. Die endgültige Plasmidkonzentration sollte ≥100 ng/μl betragen.
2. Reinigen Sie das Helferplasmid (pTNS2)⁹ und das Exzisionsplasmid (pFLP2^ab)⁶ (Abbildung 2B, C), idealerweise auf eine endgültige Plasmid-DNA-Konzentration von ≥100 ng/μl.
3. Bereiten Sie 50 ml steriles ....

Diskussion

Auch wenn dieses Verfahren zur chromosomalen Insertion eines induzierbaren Einzelkopie-Genexpressionssystems in A. baumannii technisch einfach und nicht arbeitsintensiv ist, gibt es einige wichtige Schritte, die hervorgehoben werden müssen. Zunächst muss die Präparation der kompetenten Zellen so weit wie möglich auf Eis erfolgen, da die Zellen beim Austausch des Mediums durch eiskaltes Wasser zerbrechlich werden. Idealerweise werden die Zentrifugationsschritte bei 4 °C durchgeführt, aber eine Zentrifugatio.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR tube	VWR	20170-012	For colony boil preparations and PCR reactions
1.5 mL microfuge tubes	Sarstedt	72-690-301	General use
13-mL culture tubes, Pyrex	Fisher	14-957K	Liquid culture vessels
6x DNA loading buffer	Froggabio	LD010	Agarose gel electrophoresis sample loading dye
Acetic acid, glacial	Fisher	351271-212	Agarose gel running buffer component
Agar	Bioshop	AGR003	Solid growth media
Agarose	BioBasic	D0012	Electrophoretic separation of PCR reaction products; used at a concentration of 0.8–2%
Agarose gel electrophoresis unit	Fisher	29-237-54	Agarose gel electrophoresis; separation of PCR reaction products
Carbenicillin	Fisher	50841231	Selective media
Culture tube closures	Fisher	13-684-138	Stainless steel closure for 13-mL culture tubes
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) set	Biobasic	DD0058	PCR reaction component; supplied as 100 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP; mixed and diluted for 10 mM each dNTP
Dry bath/block heater	Fisher	88860023	Isotemp digital dry bath for boil preparations
Electroporation cuvettes	VWR	89047-208	2 mm electroporation cuvettes with round cap
Electroporator	Cole Parmer	940000009	110 VAC, 60 Hz electroporator
Ethidium bromide	Fisher	BP102-1	Visualization of PCR reaction products and DNA marker in agarose gel
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	VWR	CA-EM4050	Agarose gel running buffer component
Gentamicin	Biobasic	GB0217	For the preparation of selective media
Glycerol	Fisher	G33	Preparation of bacterial stocks for long-term storage in an ultra-low freezer
Incubator (shaking)	New Brunswick Scientific	M1352-0000	Excella E24 Incubator Shaker for liquid culture growth
Incubator (static)	Fisher	11-690-550D	Isotemp Incubator Oven Model 550D for solid (LB agar) culture growth
Inoculation loop	Sarstedt	86.1562.050	Streaking colonies onto agar plates
Inoculation spreader	Sarstedt	86.1569.005	Spreading of culture onto agar plates
Lysogeny broth (LB) broth, Lennox	Fisher	BP1427	Liquid growth media (20 g/L: 5 g/L sodium chloride, 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract)
Microfuge	Fisher	75002431	Sorvall Legend Micro 17 for centrifugation of samples
Mini-centrifuge	Fisher	S67601B	Centrifugation of 0.2 mL PCR tubes
Petri dishes	SPL Life Sciences	10090	For solid growth media (agar plates): 90 x 15 mm
Pipettes	Mandel	Various	Gilson single channel pipettes (P10, P20, P200, P1000)
Power supply	Biorad	1645050	PowerPac Basic power supply for electrophoresis
Primers	IDT	NA	PCR reaction component; specific to gene of interest; prepared at 100 μM as directed on the product specification sheet
Sucrose	BioBasic	SB0498	For the preparation of counterselective media for removal of the pFLP2ab plasmid from transformed A. baumannii
Taq DNA polymerase	FroggaBio	T-500	PCR reaction component; polymerase supplied with a 10x buffer
Thermal cycler	Biorad	1861096	Model T100 for PCR
Toothpicks	Fisher	S24559	For patching colonies onto agar plates
Trizma base	Sigma	T1503	Agarose gel running buffer component
Ultrapure water	Millipore Sigma	ZLXLSD51040	MilliQ water purification system: ultra pure water for media and solution preparation, and cell washing
Wide range DNA marker	Biobasic	M103R-2	Size determination of PCR products on an agarose gel
Wooden inoculating sticks	Fisher	29-801-02	Inoculating cultures with colonies from agar plates