Blutstillung von Punktionswunden und Vorbereitung von Proben für die Montage der großflächigen elektronenmikroskopischen Analyse

Zusammenfassung

Hier wird ein Verfahren an einer Punktionswunde zur hämostatischen Thrombusbildung vorgestellt. Die gebildeten Thromben sind groß und haben einen Durchmesser von Hunderten von Mikrometern. Daher sind Volumenbildgebungsansätze geeignet. Wir empfehlen die montierte großflächige Transmissionselektronenmikroskopie als hochauflösenden Ansatz, der vielen zur Verfügung steht, und beschreiben ein präparatives Protokoll.

Zusammenfassung

Die Hämostase, der Prozess der normalen physiologischen Kontrolle von Gefäßschäden, ist für das menschliche Leben von grundlegender Bedeutung. Wir alle erleiden von Zeit zu Zeit kleinere Schnittwunden und Stichwunden. Bei der Blutstillung führt die selbstlimitierende Thrombozytenaggregation zur Bildung eines strukturierten Thrombus, bei dem die Blutstillung durch das Verschließen des Lochs von außen erfolgt. Eine detaillierte Charakterisierung dieser Struktur könnte zu Unterscheidungen zwischen Blutstillung und Thrombose führen, wobei eine übermäßige Thrombozytenaggregation zu einer okklusiven Gerinnung führt. Hier wird ein bildgebender Ansatz zur Thrombusstruktur von Punktionswunden vorgestellt, der sich auf die Fähigkeit der Dünnschliff-Elektronenmikroskopie stützt, das Innere von hämostatischen Thromben sichtbar zu machen. Der grundlegendste Schritt in jedem bildgebenden experimentellen Protokoll ist eine gute Probenvorbereitung. Das Protokoll enthält detaillierte Verfahren zur Vorbereitung von Stichwunden und plättchenreichen Thromben bei Mäusen für die anschließende Elektronenmikroskopie. Es wird ein detailliertes Verfahren für die in situ Fixierung des sich bildenden Punktionswundthrombus und dessen anschließende Verarbeitung zum Färben und Einbetten für die Elektronenmikroskopie beschrieben. Die Elektronenmikroskopie wird als Endbildgebungsverfahren vorgestellt, da sie in Kombination mit sequentiellen Schnitten in der Lage ist, die Details des Thrombusinneren mit hoher Auflösung sichtbar zu machen. Als bildgebende Methode ermöglicht die Elektronenmikroskopie eine unverzerrte Abtastung und eine experimentelle Ausgabe, die von Nanometern bis zu Millimetern in 2 oder 3 Dimensionen skaliert werden kann. Es wird eine geeignete Freeware-Elektronenmikroskopie-Software genannt, die die großflächige Elektronenmikroskopie unterstützt, bei der Hunderte von Bildern gemischt werden können, um eine Abbildung ganzer Querschnitte von Thromben im Nanometerbereich zu erhalten. Daher kann jeder Teilbereich der Bilddatei problemlos in den Kontext des gesamten Querschnitts gestellt werden.

Einleitung

Die Bildung eines Punktionswundthrombus, der zum Blutstillstand führt, ist eines der wesentlichsten Ereignisse im Leben¹. Trotz dieser Wesentlichkeit war das Wissen darüber, was strukturell während der Thrombusbildung passiert, sei es in einer Vene, einer Arterie, einem atherosklerotischen Ereignis oder einem okklusiven Gerinnsel, durch die Auflösung und die Bildgebungstiefe begrenzt. Die konventionelle Lichtmikroskopie ist im Vergleich zu einem voll ausgebildeten Thrombus aus Punktionswunden in der Tiefe von 200 bis 300 μm in Z¹ und in der Auflösung im Vergleich zur Größe der Thrombozyt....

Protokoll

Die Versuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of Arkansas for Medical Sciences geprüft und genehmigt. Hier wurden 8 - 12 Wochen alte, männliche und weibliche C57BL/6-Mäuse vom Wildtyp verwendet. Diese Mäuse sind junge Erwachsene mit geringer Fettansammlung. Die gleichen Verfahren gelten für Mausmutanten für verschiedene Proteine, die für die Blutstillung wichtig sind, wie z. B. den von-Willebrand-Faktor oder das Thrombozytenglykoprotein VI (GPVI)^5,6. Alle verwendeten Geräte, chirurgischen Instrumente, Reagenzien und anderen verwe....

Diskussion

Wir stellen ein detailliertes Verfahren an Punktionswunden zur Herstellung von hämostatischen Thromben in Jugularvenen und Oberschenkelarterien, deren in situ Perfusionsfixation und Probenaufbereitung für die montierte Breitflächen-Transmissionselektronenmikroskopie vor. Die Gesamtverfahren sind nützlich für die Erzeugung hämostatischer Thromben für die Ultrastrukturanalyse und für den Vergleich von Blutungszeiten bei Versuchsmäusen, beispielsweise Mäusen, die mit vers.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Normal Saline Solution	Medline	BHL2F7123HH
27G x 3/4 EXELint scalp vein set	Medline	NDA26709
30G x 1/2 EXELint hypodermic needles	Medline	NDA264372
33G x 1/2 EXELint specialty hypodermic needles	Medline	NDA26393
50 mL Conical Tubes	Fisher Scientific	06-443-20
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol)	Medline	MDS090670Z
Aluminum Foil	Fisher Scientific	01-213-100
Animal Heating Plate	Physitemp Instruments	HP-1M
Araldite GY 502	Electron Microscopy Sciences	10900
Axiocam 305 Color R2 Microscopy Camera	Carl Zeiss Microscopy	426560-9031-000
BD Luer-Lok Syringes, 20 mL	Medline	B-D303310Z
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C79-500
Cell Culture Dishes 35mm x 10mm	Corning Inc.	430165
Cotton Tipped Applicators	Medline	MDS202055H
DMP-30 Activator	Electron Microscopy Sciences	13600
Dodecenyl Succinic Anhydride/ DDSA	Electron Microscopy Sciences	13700
Dressing Forceps, 5", curved, serrated, narrow tipped	Integra Miltex	6-100
Dressing Forceps, 5", standard, serrated	Integra Miltex	6-6
EMBED 812 Resin	Electron Microscopy Sciences	14900
Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof	Electron Microscopy Sciences	15055
Fisherbrand 4-Way Tube Rack	Fisher Scientific	03-448-17
Fisherbrand Digital Timer	Fisher Scientific	14-649-17
Fisherbrand Single Syringe Infusion Pump	Fisher Scientific	7801001
Gauze Sponges 2" x 2"- 4 Ply	Medline	NON26224H
Glutaraldehyde (10% Solution)	Electron Microscopy Sciences	16120
Isoflurane Liquid Inhalant Anesthesia, 100 mL	Medline	66794-017-10
Jeweler-Style Micro-Fine Forceps, Style 5F	Integra Miltex	17-305	Need 2 pairs.
L/S Pump Tubing, Silicone, L/S 15; 25 Ft	VWR	MFLX96410-15
L-Aspartic Acid	Fisher Scientific	BP374-100
Lead Nitrate	Fisher Scientific	L-62
Malachite Green 4	Electron Microscopy Sciences	18100
Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head	VWR	MFLX77200-62
Masterflex L/S Variable Speed Digital Drive	VWR	MFLX07528-10
MSC Xcelite 5" Wire Cutters	Fisher Scientific	50-191-9855
Osmium Tetroxide 4% Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	19150
Paraformaldehyde (16% Solution)	Electron Microscopy Sciences	15710
Physitemp Temperature Controller	Physitemp Instruments	TCAT-2LV
Potassium Ferrocyanide	Sigma-Aldrich	P-8131
Propylene Oxide, ACS Reagent	Electron Microscopy Sciences	20401
Pyrex Glass Beakers	Fisher Scientific	02-555-25B
Rectal Temperature Probe for Mice	Physitemp Instruments	RET-3
Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000"	3M Company	305289
Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH 7.4	Electron Microscopy Sciences	11623
SomnoFlo Low Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01
SomnoFlo Starter Kit for Mice	Kent Scientific	SF-MSEKIT
Stainless Steel Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-10
Stereomicroscope steREO Discovery.V12	Carl Zeiss Microscopy	495015-9880-010
Sylgard 184 Silicone Elastomer	World Precision Instruments	SYLG184	silicone mat
Tannic Acid	Electron Microscopy Sciences	21700
Thiocarbohydrazide (TCH)	Sigma-Aldrich	88535
Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400
Vannas Spring Micro Scissors	Fine Science Tools	15000-08
Von Graefe Eye Dressing Forceps, 2.75", Curved, Serrated	Integra Miltex	18-818	Need 2 pairs.
Wagner Scissors	Fine Science Tools	14068-12
Wahl MiniFigura Animal Trimmer	Braintree Scientific	CLP-9868
Zen Lite Software	Carl Zeiss Microscopy	410135-1001-000