Escherichia coli-basierter Komplementationsassay zur Untersuchung der Chaperonfunktion des Hitzeschockproteins 70

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zeigt die Chaperon-Aktivität des Hitzeschockproteins 70 (Hsp70). E. coli dnaK756-Zellen dienen als Modell für den Assay, da sie ein natives, funktionell beeinträchtigtes Hsp70 beherbergen, was sie anfällig für Hitzestress macht. Die heterologe Einführung von funktionellem Hsp70 rettet die Wachstumsschwäche der Zellen.

Zusammenfassung

Hitzeschockprotein 70 (Hsp70) ist ein konserviertes Protein, das die Faltung anderer Proteine innerhalb der Zelle erleichtert und es zu einem molekularen Chaperon macht. Während Hsp70 für das Wachstum von E. coli-Zellen unter normalen Bedingungen nicht essentiell ist, wird dieses Chaperon für das Wachstum bei erhöhten Temperaturen unverzichtbar. Da Hsp70 hochkonserviert ist, besteht eine Möglichkeit, die Chaperonfunktion von Hsp70-Genen verschiedener Arten zu untersuchen, darin, sie heterolog in E. coli-Stämmen zu exprimieren, die entweder einen Mangel an Hsp70 aufweisen oder ein natives Hsp70 exprimieren, das funktionell beeinträchtigt ist. E. coli dnaK756-Zellen sind nicht in der Lage, λ-Bakteriophagen-DNA zu unterstützen. Darüber hinaus weist ihr natives Hsp70 (DnaK) eine erhöhte ATPase-Aktivität auf, während sie eine reduzierte Affinität zu GrpE (Hsp70-Nukleotidaustauschfaktor) aufweist. Infolgedessen wachsen E. coli dnaK756-Zellen bei Temperaturen zwischen 30 °C und 37 °C ausreichend, sterben jedoch bei erhöhten Temperaturen (>40 °C) ab. Aus diesem Grund dienen diese Zellen als Modell für die Untersuchung der Chaperonaktivität von Hsp70. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Anwendung dieser Zellen zur Durchführung eines Komplementationsassays, der die Untersuchung der In-Cellulo-Chaperon-Funktion von Hsp70 ermöglicht.

Einleitung

Hitzeschockproteine spielen eine wichtige Rolle als molekulare Chaperone, indem sie die Proteinfaltung erleichtern, die Proteinaggregation verhindern und die Fehlfaltung von Proteinen umkehren ^1,2. Das Hitzeschockprotein 70 (Hsp70) ist eines der bekanntesten molekularen Chaperone und spielt eine zentrale Rolle bei der Proteinhomöostase ^3,4. DnaK ist das E. coli Hsp70-Homolog⁵.

Verschiedene biophysikalische, biochemische und zellbasierte Assays wurden entwickelt, um die Chaperon-Aktivität von ....

Protokoll

1. Verwandlung

HINWEIS: Verwenden Sie sterile Glaswaren für Kulturen, Pipettenspitzen und frisch zubereitete und autoklavierte Medien. Bereiten Sie Kulturen der E. coli-Zellen in 2x Hefe-Trypton (YT) [1,6% Trypton (w/v), 1% Hefeextrakt (w/v), 0,5% NaCl (w/v), 1,5% Agar (w/v)] Agar vor. Allgemeine Reagenzien, die im Protokoll verwendet werden, und ihre Quellen sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. 2,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen markieren und 50 μl kompetente E. coli dnaK756-Zellenaliquotieren, die Zellen auf Eis halten.
2. In die 2,0-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit kompe....

Diskussion

Das Protokoll demonstriert den Nutzen von E. coli dnaK756-Zellenbei der Erforschung der Chaperonfunktion von heterolog exprimiertem Hsp70. Dieser Assay könnte zum Screening von Inhibitoren eingesetzt werden, die auf die Hsp70-Funktion in Cellulo abzielen. Eine Einschränkung dieser Methode besteht jedoch darin, dass Hsp70s, die DnaK in E. coli nicht ersetzen können, mit diesem Assay nicht kompatibel sind. Das Fehlen einer posttranslationalen Modifikation²¹ einiger nich.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	8,05,740	Constituent for sample loading dye
Acetic acid	Labchem	101005125	Constituent of destainer
Acrylamide	Sigma-Aldrich	8008300100	Component of SDS
Agar	Merck	HG000BX1.500	Constituent of medium and liquid growth assay
Agarose	Clever Scientific	14131031	Certified molecular biology agarose
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	101875295	Constituent for SDS-PAGE gel
Ampicillin	VWR International	0339—EU—25G	Selective antibiotic
Bis	Sigma-aldrich	1015460100	Component of SDS
Bromophenol	Sigma-Aldrich	0449-25G	Constituent for sample loading dye
CaCl2	Sigma-Aldrich	10043-52-4	For competent cells preparation
Coomassie brilliant blue	VWR International	443293X	SDS-PAGE dye
Dibasic sodium phosphate	Sigma-Aldrich	RB10368	Constituent of PBS buffer
ECL	Thermofischer Scientific	32109	Western blot detection reagent
Ethidium Bromide	Thermofischer Scientific	17898	DNA intercalating dye
Glycerol	Merck	SAAR2676520L	Constituent for sample loading dye
Glycine	VWR International	10119CU	Component of SDS
IPTG	Glentham life sciences	162IL	inducer
Kanamycin	Melford	K0126	Selective antibiotic
Magnesium Chloride	Merck	SAAR4123000EM	Constituent of medium and liquid growth assay
Methanol	Labchem	113140129	Constituent of destainer
Monobasic potassium phosphate	Merck	1,04,87,30,250	Constituent of PBS buffer
Peptone	Merck	HG000BX4.250	Constituent of medium and liquid growth assay
Potassium chloride	Merck	SAAR5042020EM	Constituent of PBS buffer
PVDF membrane	Thermofischer scientific	PB7320	Western blot membrane
Sodium Chloride	Merck	SAAR5822320EM	Constituent of medium and liquid growth assay
Sodium dodecyl sulphate	VWR International	108073	To resolve expressed proteins
Spectramax iD3	Separations	373705019	Automated plate reader
TEMED	VWR international	ACRO420580500	Component of SDS gel
Tetracycline	Duchefa Biochemies	T0150.0025	Selective antibiotic
Tris	VWR International	19A094101	Component of SDS gel
Tween20	Merck	SAAR3164500XF	Constituent for Western wash buffer
Western transfer chamber	Thermofisher Scientific	PB0112	Transfer of protein to nitrocellulose membrane
Yeast extract	Merck	HG000BX6.500	Constituent of medium and liquid growth assay
α-DnaK antibody	Inqaba	BK CAC09317	Primary antibody
α-rabbit antibody	Thermofischer scientific	31460	Secondary antibody