Erweiterte 78%-Hepatektomie in einem chirurgischen Mausmodell

Zusammenfassung

Das Mausmodell der partiellen 2/3 (66%) Hepatektomie ist in der Literatur gut beschrieben, aber ausgedehntere Hepatektomien, die das Small-for-Size-Syndrom nach Lebertransplantation nachahmen, wurden selten verwendet. Wir beschreiben eine erweiterte 78%ige Hepatektomie in einem Mausmodell, die bei gesunden Mäusen zu einer postoperativen Letalität von etwa 50% führt.

Zusammenfassung

Die partielle 2/3-Hepatektomie bei Mäusen wird in der Forschung eingesetzt, um die Regenerationsfähigkeit der Leber zu untersuchen und die Ergebnisse der Leberresektion in einer Reihe von Krankheitsmodellen zu untersuchen. Bei der klassischen partiellen 2/3-Hepatektomie bei Mäusen werden zwei der fünf Leberlappen, nämlich der linke und der Medianlappen, die etwa 66 % der Lebermasse ausmachen, en bloc reseziert, wobei ein postoperatives Überleben von 100 % erwartet wird. Aggressivere partielle Hepatektomien sind technisch anspruchsvoller und werden daher bei Mäusen nur selten eingesetzt. Unsere Gruppe hat ein Mausmodell einer erweiterten Hepatektomietechnik entwickelt, bei der drei der fünf Leberlappen, einschließlich des linken, mittleren und rechten oberen Lappens, separat reseziert werden, um etwa 78% der gesamten Lebermasse zu entfernen. Diese verlängerte Resektion bei ansonsten gesunden Mäusen hinterlässt eine Restleber, die nicht immer eine angemessene und rechtzeitige Regeneration aufrechterhalten kann. Ein Versagen der Regeneration führt letztendlich zu einer postoperativen Letalität von 50 % innerhalb von 1 Woche aufgrund eines fulminanten Leberversagens. Dieses Verfahren der erweiterten 78%-Hepatektomie bei Mäusen stellt ein einzigartiges chirurgisches Modell für die Untersuchung des Small-for-Size-Syndroms und die Bewertung therapeutischer Strategien zur Verbesserung der Leberregeneration und der Ergebnisse im Rahmen einer Lebertransplantation oder einer erweiterten Leberresektion bei Krebs dar.

Einleitung

Chirurgische Leberresektionsmodelle von Mäusen und Ratten, die erstmals 1931 beschrieben wurden, sind die gebräuchlichsten experimentellen Modelle, die zur Untersuchung der molekularen Grundlagen der Leberregeneration verwendet werden. Sie könnten auch in der translationalen wissenschaftlichen Forschung nützlich sein, um Strategien zur Verbesserung der Ergebnisse nach längerer Leberresektion oder Transplantation suboptimaler Lebertransplantate zu testen und zu entwickeln 1,2,3,4. Partielle Hepektomien (PH) bei Mäusen führen zur Entfernung von etwa 2/3 (66 %) der gesamten Lebermasse (TLM), die bei gesunden Tieren zu außergewöhnlichen Ergebnissen führen⁵. Das Verfahren ist von kurzer Dauer, aufgrund geringer Unterschiede in der Anatomie der Mausleber leicht reproduzierbar, und das postoperative Überleben liegt in der Regel bei nahezu 100 %¹.

Die partielle 2/3-Hepatektomie, die die Resektion des linken Lappens (LL) und des Medianlappens (ML) umfasst, ermöglicht eine relativ ungehinderte Regeneration der Restlappen durch eine Lappenentzündung oder eine Einschränkung des hepatischen Zu- und Abflusses. Vielmehr führen ein erhöhter portalvenöser Fluss und die anschließende Scherbelastung der sinusförmigen Endothelzellen der Leber nach PH zu einer anhaltenden Hochregulierung der Expression der endothelialen Stickstoffmonoxidsynthase (eNOS) und der anschließenden Freisetzung von Stickstoffmonoxid (NO), was zur Vorbereitung der Hepatozyten für die Proliferation und Leberregeneration beiträgt³. Zu den Ergebnissen, die häufig nach 2/3 PH in Krankheitsmodellen wie der nichtalkoholischen Fettlebererkrankung oder in bestimmten genetischen Hintergründen untersucht werden, gehören das Risiko eines akuten Leberversagens, qualitative und quantitative Messungen der Regenerationsfähigkeit der Leber und andere biologische Reaktionen auf Stress oder traumatische Verletzungen ^1,3.

Ein Mausmodell, das das funktionelle oder anatomische Small-for-Size-Syndrom nachahmt, wie es nach einer verlängerten Leberresektion bei Krebs oder einer Transplantation von marginalen (Steatose oder verlängerte ischämische Zeit) oder partiellen (gespaltenen oder aus der lebenden Spenderleber) Lebertransplantaten auftritt, ist jedoch noch nicht gut etabliert. Um diesem Bedarf gerecht zu werden, sind Modelle umfangreicherer Leberresektionen erforderlich, die über die Aufrechterhaltung einer minimalen (und funktionellen) Lebermasse hinausgehen, um das Small-for-Size-Lebersyndrom und die mit diesem Syndrom verbundene erhöhte Mortalität zu modellieren ^6,7.

Die Anatomie der Leber von Mäusen weist minimale Variationen auf. Die Leber der Maus besteht aus fünf Lappen, die jeweils den folgenden Prozentsatz der gesamten Lebermasse ausmachen: linker Lappen (LL; 34,4 ± 1,9 %), Medianlappen (ML; 26,2 ± 1,9 %), rechter oberer (auch rechter oberer Lappen genannt) (RUL; 16,6 ± 1,4 %), rechter unterer (auch rechter unterer Lappen genannt) (RLL; 14,7 ± 1,4 %) und Schwanzlappen (CL, 8,1 ± 1,0 %)^{1, 5}. Urheberrecht Jeder Lappen wird von einer Pfortadertriade versorgt, die einen Ast der Leberarterie, einen Ast der Pfortader und einen Gallengang⁵ umfasst. In der Vergangenheit wurden mehrere Techniken beschrieben, um eine 2/3 PH durch Resektion des LL und des ML durchzuführen. Dazu gehören 1) die klassische Technik, die aus einer einzigen Ligatur en bloc an der Basis jedes resezierten Lappens besteht; 2) die hämostatische Clip-Technik, bei der Titanclips an der Basis der resezierten Lappen angebracht werden; 3) eine gefäßorientierte parenchymerhaltende Technik unter Verwendung von Piercingnähten proximal der Klemme; und 4) eine gefäßorientierte mikrochirurgische Technik, bei der die Pfortader- und Leberarterienäste vor der Lappenresektion^{ligiert werden 1}. Obwohl jede Technik relative Stärken und Schwächen aufweist, führt keine zu einer höheren Letalität ^1,8,9.

In dieser Studie stellen wir eine neuartige Methode für eine verlängerte PH von 78% bei Mäusen vor. In diesem Modell werden drei von fünf Leberlappen, einschließlich LL, ML und RUL, separat mit einer Ligaturtechnik entfernt (Abbildung 1). Dieses Verfahren führt zur Resektion von etwa 78 % (77,2 ± 5,2 %) der gesamten Lebermasse. Unsere Entscheidung, LL und ML getrennt zu entfernen und nicht "en bloc" wie bei der klassischen PH-Technik, minimiert Komplikationen, die mit einer En-bloc-Resektion dieser beiden Lappen verbunden sind, wie z. B. eine suprahepatische Hohlvenenstenose und ein erhöhtes Risiko einer Nekrose der verbleibenden Lappen, wenn die einzelne Ligatur zu nahe an der Hohlvene angelegt wird^1. 10,11,12,13,14. Dies ist entscheidend, bevor Sie zum letzten Schritt dieses Verfahrens übergehen, um die RUL zu entfernen. Diese umfangreiche Hepatektomie bei 8-12 Wochen alten Wildtyp-Mäusen mit C57BL/6 führt innerhalb von 1 Woche nach der Operation zu einer Letalität von 50 % aufgrund einer fehlgeschlagenen Leberregeneration, die zu einem fulminanten Leberversagen führt^15,16. Dieses Mausmodell mit erhöhter Letalität nach erweiterter 78%-Hepatektomie rekapituliert die Pathophysiologie des Small-for-Size-Syndroms angemessen und ermöglicht die Entwicklung und Erprobung neuartiger Strategien zur Verbesserung der Ergebnisse.

Protokoll

Die in diesem Verfahrensprotokoll beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Beth Israel Deaconess Medical Center (BIDMC) genehmigt. Alle Versuche wurden in Übereinstimmung mit der IACUC und den Richtlinien für Tierversuchseinrichtungen BIDMC durchgeführt.

1. Präoperative Vorbereitung der Maus

1. Rasieren Sie den Bauch der Maus vom mittleren Brustbein bis zur suprapubischen Region mit einer Schermaschine.
2. Induzieren Sie eine Vollnarkose mit 1-4% Isofluran in 100% Sauerstoff. Legen Sie die Maus nach der Betäubung in Rückenlage auf das Operationsfeld mit einem Heizkissen darunter. Bevor Sie einen Schnitt machen, kneifen Sie den Zeh fest ein, um sicherzustellen, dass der Pedalreflex nicht vorhanden ist (falls vorhanden, reagiert das Tier). Passen Sie die Anästhesiestärke nach Bedarf an, um einen Zustand der Vollnarkose zu erreichen.
   HINWEIS: Titrieren Sie Isofluran nach Bedarf, um eine angemessene Vollnarkose aufrechtzuerhalten.
3. 1,2 mg/kg Buprenorphin mit verlängerter Freisetzung (ER) subkutan zur postoperativen Analgesie verabreichen. Legen Sie die Maus mit ausgestreckten Vorder- und Hinterbeinen in Rückenlage und sichern Sie die Gliedmaßen mit Klebeband. Bereiten Sie dann ein steriles Feld für die Operation vor.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Vordergliedmaßen entspannt sind, wenn sie gesichert sind, damit die Atmung nicht behindert wird.
4. Bereiten Sie den Bauch mit warmen, sterilen Kochsalzlösungs- und Betadinabstrichen vor, wobei Sie jeden Tupfer 3 Mal abwechseln. Drapieren Sie den Bauch steril.

2. Hepatektomie

1. Machen Sie mit einem Skalpell einen vertikalen Mittellinien-Laparotomieschnitt durch die Haut vom Xiphoidfortsatz bis zur suprapubischen Region. Als nächstes schneiden Sie mit einer scharfen Schere durch die Linea alba, um in die Bauchhöhle einzudringen, und verlängern Sie diesen Schnitt bis zur Länge des Hautschnitts.
   HINWEIS: Es ist sicherer, die Linea alba zuerst in der subxiphoiden Region zu schneiden, wo die Leber tief in der Bauchdecke liegt, um eine Verletzung des darunter liegenden Darms zu vermeiden.
2. Ziehen Sie die Bauchdecke mit geeigneten Retraktoren seitlich zurück. Klemmen Sie dann den Xiphoid-Prozess mit einem Blutstiller und ziehen Sie das Brustbein nach oben zurück, um die Leber freizulegen.
3. Ziehen Sie die Leber nach unten zurück, um das falciforme Band freizulegen, und durchtrennen Sie dann das Band mit einer scharfen Schere entlang der Leber. Ziehen Sie die Leber nach oben in Richtung Thorax zurück, um das Leberband und die intrahepatischen Lappenbänder freizulegen, und durchtrennen Sie diese Strukturen mit einer scharfen Mikroschere.
   HINWEIS: Die Retraktion sollte sehr vorsichtig mit feuchten Applikatoren mit Wattespitze durchgeführt werden, da die Leber, die von der Glisson-Kapsel eingekapselt ist, sehr zerbrechlich ist und leicht zu Blutergüssen und Rissen führt.
4. Ziehen Sie den Medianlappen nach oben zurück, während Sie den linken Lappen in seiner ursprünglichen anatomischen Position halten. Wickeln Sie eine 5-0-Seidennaht um den superior-medialen Teil des LL. Reflektieren Sie das LL nach oben in Richtung Thorax, um die Unterseite des Lappens freizulegen, führen Sie die Nahtenden an der Basis des Lappens zusammen und binden Sie die Naht an der Basis. Stellen Sie sicher, dass die Naht den Blutfluss in der unteren Hohlvene (IVC) oder der Pfortader nicht behindert, bevor Sie die Naht binden, um die LL zu ligieren.
   HINWEIS: Es ist am besten, diese Naht zu binden, während die LL in Richtung Thorax reflektiert wird, so dass die Portaltriade während der Ligatur gut freigelegt ist. Dies ermöglicht die Resektion des Keulens nahe der Basis, ohne die angrenzenden Strukturen zu beeinträchtigen.
5. Sezieren Sie das LL mit einer scharfen Schere nur distal des Nahtbinders und stellen Sie sicher, dass eine kleine Gewebemanschette (~2 mm) die Naht vom Rand des resezierten Lappens trennt. Bestätigen Sie die Hämostase.
6. Reflektieren Sie den Medianlappen nach oben in Richtung Thorax, legen Sie eine 5-0-Seidennaht um die Basis des ML und bringen Sie den ML wieder in seine ursprüngliche anatomische Position. Nähern Sie sich den Nahtenden über der Basis des oberen Aspekts des ML an und stellen Sie sicher, dass sie an der Basis des Lappens gebunden sind. Sezieren Sie das ligierte ML erneut, wobei eine kleine Manschette aus Geweberesten um den Nahtbinder herum verbleibt. Bestätigen Sie die Hämostase.
7. Mobilisieren Sie die Leber von rechts nach links, um den rechten oberen und unteren Lappen freizulegen und diese Lappen vorsichtig medial und inferior zu reflektieren. Wickeln Sie eine 5-0-Naht über den superior-medialen Aspekt des RUL, um sicherzustellen, dass die Naht die RUL-Basis umgibt, und reflektieren Sie dann die RUL in Richtung Thorax. Wickeln Sie die Naht unter das RUL und binden Sie die Enden nahe an der Basis zusammen, dann resezieren Sie sie, wobei Sie eine kleine Manschette aus Geweberesten um das Nahtband herum lassen.
   HINWEIS: Eine zu proximale Bindung an der Basis des RUL kann die Blutversorgung des RLL beeinträchtigen, was innerhalb von 24 Stunden postoperativ zu einer Ischämie des RLL und zum Tod der Maus führen kann. Im Gegensatz dazu verringert eine zu distale Bindung an die RUL-Basis die Menge der resezierten Lebermasse, wodurch die postoperativen Überlebensraten über das erwartete Maß hinaus erhöht werden.
8. Bringen Sie die verbleibende Leber wieder in ihre anatomische Ruheposition zurück und sorgen Sie für die Blutstillung. Falls erforderlich, üben Sie mit Gaze Druck auf Bereiche mit leichten Blutungen an resezierten Leberrändern aus.
9. Die Bauchdecke der Mittellinie (Faszien und Muskelschichten) mit einer 5-0-Polyglactin-Naht ununterbrochen verschließen. Verschließen Sie den Hautschnitt mit Klammern oder 5-0 Monofilamentnähten.
10. Brechen Sie die Anästhesie ab und überwachen Sie die Maus, bis sie wieder zu Bewusstsein kommt und normal gehen kann.

3. Nachsorge

1. Beobachten Sie die Maus postoperativ, um eine angemessene Genesung (d. h. die Maus ist wach, aufmerksam und ambulant im Käfig) und eine angemessene Schmerzkontrolle zu gewährleisten. Untersuchen Sie die Maus alle 2 Stunden bis 6 Stunden nach dem Eingriff und dann täglich.
   HINWEIS: Es ist zu erwarten, dass sich die Maus postoperativ langsamer innerhalb des Käfigs bewegt. Die Maus sollte sich in einem isolierten Käfig von anderen Mäusen erholen und erst dann in die Gesellschaft anderer Mäuse zurückkehren, wenn sie vollständig genesen ist.
2. Verabreichen Sie erwärmte normale Kochsalzlösungsinjektionen (0,1-1,0 ml, subkutan oder intraperitoneal), wenn die Maus durch unempfindliche Flüssigkeit oder übermäßigen Blutverlust durch die Operation hypovolämisch wird.

Ergebnisse

Es wird erwartet, dass eine erfolgreiche verlängerte 78%-Hepatektomie bei gesunden erwachsenen Mäusen im Alter von 8-12 Wochen innerhalb von 1 Woche eine Mortalität von 50% induziert¹⁶. Bei ordnungsgemäßer Durchführung ist ein minimaler Blutverlust zu erwarten. Anhaltende Restblutungen können durch manuellen Druck kontrolliert werden. Der perioperative Tod innerhalb von 24 Stunden nach der Operation wird oft durch technische Fehler verursacht. Zu den technischen Fehlern gehören die versehe...

Diskussion

Um eine erweiterte 78%ige Hepatektomie mit einer Letalität von 50% bei Mäusen erfolgreich durchzuführen, ist es entscheidend, dass jeder Leberlappen präzise reseziert wird. Dieses Maß an Kompetenz und Präzision kann nur erreicht werden, wenn der Eingriff wiederholt durchgeführt wird. Die Schulungskurve variiert je nach Bediener, erfordert aber in der Regel 3-6 Monate Übung. Eine Leberresektion, bei der weniger als 78 % des TLM entfernt werden, würde zu höheren Überlebensraten führen, während eine Leberresekt...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 x 2 Gauze	Covidien	2146	Surgery: dissection
5-O Nylon Monofilament Suture	Oasis	50-118-0631	Surgery: Skin closure
5-O Silk Suture	Fine Science Tools	18020-50	Surgery: liver lobe ligation
5-O Vicryl Suture	Ethicon	NC9335902	Surgery: Abdominal wall closure
Addson Forceps	Braintree Scientific	FC028	Surgery: dissection
Alcohol Swabs (2)	BD	326895	Disinfectant
Buprenorphine Extended Release Formulation	Zoopharm	N/A	Analgesia
Cordless Trimmer	Braintree Scientific	CLP-9868-14	Shaving
Curved Forceps	Braintree Scientific	FC0038	Surgery: dissection
Hemostat	Braintree Scientific	FC79-1	Surgery: dissection
Isoflurane Inhalant Anesthetic	Patterson Veterinary	RXISO-250	General Anesthesia
Magnet Fixator (2-slot) (2)	Braintree Scientific	ACD-001	Surgery: to hold small retractors
Magnet Fixator (4-slot)	Braintree Scientific	ACD-002	Surgery: to hold small retractors
Microscissors	Braintree Scientific	SC-MI 151	Surgery: dissection
Operating tray	Braintree Scientific	ACD-0014	Surgery: for establishment of surgical field
Povidone Iodine 10% Swabstick (2)	Medline	MDS093901ZZ	Disinfectant
Scalpel (15-blade)	Aspen Surgical Products	371615	Surgery: dissection
Sharp Scissors (Curved)	Braintree Scientific	SC-T-406	Surgery: dissection
Sharp Scissors (Straight)	Braintree Scientific	SC-T-405	Surgery: dissection
Small Cotton-Tipped Applicators	Fisher Scientific	23-400-118	Surgery: dissection
Tissue Forceps (Straight x2)	Braintree Scientific	FC1001	Surgery: dissection
Warming Pad (18" x 26")	Stryker	TP 700	Warming
Warming Pad Pump	Stryker	TP 700	Warming
Wire Handle Retractor (2)	Braintree Scientific	ACD-005	Surgery: to facilitate exposure of peritoneal cavity
Xenotec Isoflurane Small Animal Anesthesia System	Braintree Scientific	EZ-108SA	General Anesthesia: Contains Isoflurane vaborizer & console, Induction chamber, Regulator/Hose, Facemask (M)