Synthese und Assay von Vibrio Quorum Sensing Inhibitoren

Zusammenfassung

Thiophenesulfonamidverbindungen sind potente und spezifische Inhibitoren der Vibrio quorum sensing Regulatoren LuxR/HapR, die deren Aktivität in vivo blockieren und so die Transkription von Genen für Virulenz, Motilität und Biofilme verhindern. Dieses Protokoll beschreibt, wie diese Verbindungen synthetisiert, in silico modelliert und in vivo auf ihre Aktivität gegen LuxR/HapR getestet werden.

Zusammenfassung

Bakterien ermitteln die Anzahl der lokalen Populationen mithilfe von Quorum Sensing, einer Methode der Zell-Zell-Kommunikation, die häufig zur Kontrolle des Verhaltens von Bakterien eingesetzt wird. Bei Vibrio-Spezies kontrollieren die Master-Quorum-Sensing-Regulatoren LuxR/HapR Hunderte von Quorum-Sensing-Genen, von denen viele Virulenz, Stoffwechsel, Motilität und mehr beeinflussen. Thiophenesulfonamide sind potente Inhibitoren von LuxR/HapR, die die Ligandentasche in diesen Transkriptionsfaktoren binden und die nachgeschaltete Genexpression des Quorum Sensing blockieren. Diese Klasse von Verbindungen diente als Grundlage für die Entwicklung einer Reihe einfacher, robuster und lehrreicher Verfahren für College-Studenten, um ihre chemischen und biologischen Fähigkeiten mithilfe eines CURE-Modells zu assimilieren: kursbasierte Forschungserfahrung im Grundstudium. Es werden optimierte Protokolle beschrieben, die drei Lernphasen in einer iterativen und multidisziplinären Plattform umfassen, um die Studierenden in ein einjähriges CURE einzubeziehen: (1) Entwicklung und Synthese neuer niedermolekularer Inhibitoren auf Basis des Thiophensulfonamid-Kerns, (2) Verwendung von Strukturmodellierung zur Vorhersage der Bindungsaffinität zum Ziel und (3) Assay der Verbindungen auf Wirksamkeit in mikrobiologischen Assays gegen spezifische Vibrio LuxR/HapR-Proteine. Der beschriebene Reporter-Assay, der in E. coli durchgeführt wurde, sagt erfolgreich die Wirksamkeit der Verbindungen gegen Zielproteine in der nativen Vibrio-Spezies voraus.

Einleitung

Bakterien erfassen die Populationsdichte und die Art der Zellen in der Nähe mithilfe eines Zell-Zell-Kommunikationsprozesses, der als Quorum Sensing (QS)¹ bezeichnet wird. Verschiedene Bakteriengruppen nutzen QS, um verschiedene Verhaltensweisen zu steuern, wie z. B. Motilität, Biofilmbildung, Virulenzfaktorsekretion und mehr. Die Proteine und Signale, die an QS beteiligt sind, unterscheiden sich stark zwischen Bakterien. Bei Vibrio-Spezies verwendet das QS-Signalsystem überwiegend membrangebundene hybride Histidin-Kinase-Rezeptoren, die spezifische verwandte Signale kleiner Moleküle erkennen, die als ....

Protokoll

Die Einzelheiten zu den Reagenzien und den für die Studie verwendeten Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Design und Synthese von Thiophenesulfonamid-Bibliotheken

HINWEIS: Thiophenesulfonamid-Inhibitoren wie 3-Phenyl-1-(Thiophen-2-ylsulfonyl)-1-H-pyrazol (PTSP) werden über die einstufige basengeförderte Kondensation ^8,9 synthetisiert, wie in Abbildung 2 gezeigt. Um neue Verbindungsbibliotheken für Studien zu entwickeln, müssen F....

Diskussion

Dieses CURE wurde ursprünglich als verkürztes zweistufiges, dreiwöchiges Protokoll (Design/Synthese und Assay) entwickelt und in fünf Semestern im Rahmen eines organischen Praktikums der Oberstufe^{implementiert 8}. Seit dem ursprünglichen Bericht wurde das Computermodellierungsmodul hinzugefügt und der E. coli-Assay für unerfahrene Forscher optimiert. Das daraus resultierende dreistufige, zweisemestrige Protokoll wurde dreimal im Rahmen des Arts and .......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-thiophensulfonyl chloride	Ambeed	A258464
3-Phenyl-1H-pyrazole	Ambeed	A104401	98%
96-well clear bottom black plates	USA Scientific	5665-5090Q	96-well polystyrene uClear black TC plate with lid, clear flat bottom, sterile, 8/sleeve, 32/case
Autodock Tools			http://mgltools.scripps.edu/downloads
Autodock Vina			https://vina.scripps.edu
Chloramphenicol
DMSO
ethyl acetate	Fisher Scientific	AA31344M4	Reagent grade
hexanes	Fisher Scientific	H291
Kanamycin
magnesium sulfate	Fisher Scientific	M65-500	Anhydrous
Microporous Film	USA Scientific	2920-1010	Microporous Film, -20degC to +80degC, 50/box, Sterilized
molview			molview.org
NaCl
Protein Databank			https://www.rcsb.org/
Pymol			https://pymol.org/2/
Qualitative filter paper	Fisher Scientific	09-805-342	Cytiva Whatman™ Qualitative Filter Paper: Grade 1 Circles, 47 mm
Silica gel	Sorbtech	30930M-25	Silica Gel, Standard Grade, 60A, 40-63um (230 x 400 mesh)
Sodium hydride	Millipore Sigma	452912	60 % dispersion in mineral oil
Tetrahydrofuran	Fisher Scientific	MTX02847	Tetrahydrofuran, anhydrous, 99.9%, ACS Grade, DriSolv
TLC Plates	Sorbtech	1634067	Silica gel TLC plates, aluminum backed
Tryptone
webina			https://durrantlab.pitt.edu/webina/
Yeast Extract