Synthese und Assay von Vibrio Quorum Sensing Inhibitoren

Zusammenfassung

Thiophenesulfonamidverbindungen sind potente und spezifische Inhibitoren der Vibrio quorum sensing Regulatoren LuxR/HapR, die deren Aktivität in vivo blockieren und so die Transkription von Genen für Virulenz, Motilität und Biofilme verhindern. Dieses Protokoll beschreibt, wie diese Verbindungen synthetisiert, in silico modelliert und in vivo auf ihre Aktivität gegen LuxR/HapR getestet werden.

Zusammenfassung

Bakterien ermitteln die Anzahl der lokalen Populationen mithilfe von Quorum Sensing, einer Methode der Zell-Zell-Kommunikation, die häufig zur Kontrolle des Verhaltens von Bakterien eingesetzt wird. Bei Vibrio-Spezies kontrollieren die Master-Quorum-Sensing-Regulatoren LuxR/HapR Hunderte von Quorum-Sensing-Genen, von denen viele Virulenz, Stoffwechsel, Motilität und mehr beeinflussen. Thiophenesulfonamide sind potente Inhibitoren von LuxR/HapR, die die Ligandentasche in diesen Transkriptionsfaktoren binden und die nachgeschaltete Genexpression des Quorum Sensing blockieren. Diese Klasse von Verbindungen diente als Grundlage für die Entwicklung einer Reihe einfacher, robuster und lehrreicher Verfahren für College-Studenten, um ihre chemischen und biologischen Fähigkeiten mithilfe eines CURE-Modells zu assimilieren: kursbasierte Forschungserfahrung im Grundstudium. Es werden optimierte Protokolle beschrieben, die drei Lernphasen in einer iterativen und multidisziplinären Plattform umfassen, um die Studierenden in ein einjähriges CURE einzubeziehen: (1) Entwicklung und Synthese neuer niedermolekularer Inhibitoren auf Basis des Thiophensulfonamid-Kerns, (2) Verwendung von Strukturmodellierung zur Vorhersage der Bindungsaffinität zum Ziel und (3) Assay der Verbindungen auf Wirksamkeit in mikrobiologischen Assays gegen spezifische Vibrio LuxR/HapR-Proteine. Der beschriebene Reporter-Assay, der in E. coli durchgeführt wurde, sagt erfolgreich die Wirksamkeit der Verbindungen gegen Zielproteine in der nativen Vibrio-Spezies voraus.

Einleitung

Bakterien erfassen die Populationsdichte und die Art der Zellen in der Nähe mithilfe eines Zell-Zell-Kommunikationsprozesses, der als Quorum Sensing (QS)¹ bezeichnet wird. Verschiedene Bakteriengruppen nutzen QS, um verschiedene Verhaltensweisen zu steuern, wie z. B. Motilität, Biofilmbildung, Virulenzfaktorsekretion und mehr. Die Proteine und Signale, die an QS beteiligt sind, unterscheiden sich stark zwischen Bakterien. Bei Vibrio-Spezies verwendet das QS-Signalsystem überwiegend membrangebundene hybride Histidin-Kinase-Rezeptoren, die spezifische verwandte Signale kleiner Moleküle erkennen, die als Autoinduktoren^{bezeichnet werden 2} (Abbildung 1). Diese Rezeptoren steuern den Fluss von Phosphat durch das System zu einem Reaktionsregulator, der kleine RNAs transkribiert. Die Produktion von sRNAs verändert die Produktion des Master-Quorum-Sensing-Regulators, der als eine konservierte Gruppe von Proteinen definiert ist, die zusammen als LuxR/HapR³ bezeichnet wird. So wird bei niedrigen Zelldichten die mRNA, die für LuxR/HapR kodiert, durch sRNA-Targeting abgebaut, und bei hoher Zelldichte wird das LuxR/HapR-Protein in maximalen Konzentrationen produziert (überprüft in Ball et ^al.3).

Die LuxR/HapR-Gruppe von Proteinen gehört zur großen Gruppe der TetR-Proteine, die durch das Vorhandensein einer Helix-Turn-Helix in der DNA-Bindungsdomäne, die Bildung eines funktionellen Homodimers und typischerweise den Einschluss einer Ligandenbindungsdomäne^{definiert ist 4}. Die Vibrio LuxR/HapR-Proteine erfüllen alle diese Kriterien, obwohl noch kein Ligand identifiziert wurde. Das LuxR/HapR-Protein in allen untersuchten Vibrio-Spezies steuert zahlreiche nachgeschaltete Verhaltensweisen, von denen viele als wichtig für die Pathogenese bekannt sind: Produktion von Biofilmen, Proteasen, Zelltoxinen, Hämolysinen, Typ-III-Sekretion und Typ-VI-Sekretionskomplexen^{und mehr 3}. Die Deletion des LuxR/HapR-Proteins führt zu einer Abnahme oder einem Verlust der Virulenz in den Wirtssystemen ^5,6,7, was zu der Hypothese führt, dass die Hemmung dieser Proteine eine praktikable Strategie ist, um dem Fortschreiten der Krankheit entgegenzuwirken. Vibrio-Arten verursachen die Vibriose-Krankheit bei Meeresorganismen, einschließlich Fischen, Schalentieren und Korallen, sowie bei Menschen, die mit bestimmten Arten in Kontakt kommen oder diese aufnehmen.

Frühere Forschungen haben eine Reihe von Thiophenesulfonamidverbindungen identifiziert, die spezifisch an die Ligandenbindungsdomäne von LuxR/HapR-Proteinen in mehreren Vibrio-Spezies binden, um deren Funktion zu blockieren ^5,8,9 (Abbildung 1). Mit Hilfe eines Reporterscreenings in E. coli wurden die Verbindungen identifiziert und anschließend im nativen Vibrio getestet, was eine hohe Korrelation zwischen der Wirkung in den heterologen E. coli und der Wirksamkeit in der Vibrio⁹ zeigte. Diese Verbindungen sind einfach in einem einzigen Schritt zu synthetisieren und eignen sich daher ideal für die Synthese kleiner Bibliotheken im Rahmen eines Labors in chemischer Biologie. Über eine dreiwöchige, kursbasierte Undergraduate Research Experience (CURE), die auf diesem molekularen Gerüst basierte, wurde bereits berichtet⁸. Dieses dreiwöchige Modul wurde in diesem einjährigen CURE weiter optimiert, gestrafft und erweitert, das auf die Hemmung von LuxR/HapR-Proteinen in verschiedenen Vibrio-Spezies abzielt.

Protokoll

Die Einzelheiten zu den Reagenzien und den für die Studie verwendeten Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Design und Synthese von Thiophenesulfonamid-Bibliotheken

HINWEIS: Thiophenesulfonamid-Inhibitoren wie 3-Phenyl-1-(Thiophen-2-ylsulfonyl)-1-H-pyrazol (PTSP) werden über die einstufige basengeförderte Kondensation ^8,9 synthetisiert, wie in Abbildung 2 gezeigt. Um neue Verbindungsbibliotheken für Studien zu entwickeln, müssen Forscher geeignete Amine und Sulfonylchloride beschaffen und die unten zusammengefassten Schritte befolgen. Wenn sich die Struktur des Amins stark von der des aromatischen Pyrazolderivats unterscheidet, müssen möglicherweise alternative Reaktionsbedingungen durch Literaturrecherche identifiziert werden. Dieses Verfahren ist robust, und Basen wie Natriumhydroxid, Triethylamin und Pyridin haben ebenfalls gut funktioniert. Wenn dies in einem Kurs durchgeführt wird, können die Studierenden die Freiheit haben, ihr eigenes Verfahren mit wahrscheinlich günstigen Ergebnissen zu wählen.

1. Synthese und Isolierung von PTSP
   HINWEIS: Dies kann in einer 3-stündigen Laborperiode abgeschlossen werden.
   1. 822 mg Phenylpyrazol (5,7 mmol des Amins, 1,5 Äq.) in 15 ml Tetrahydrofuran werden in einem 50-ml-Rundkolben mit einem Rührstab gelöst.
   2. Fügen Sie langsam 306 mg Natriumhydrid (60 % in Öl, 7,65 mmol, 2 Äquivalente) hinzu, um eine Suspension zu erhalten. Lassen Sie diese Suspension auf einer Rührplatte 10 min rühren.
   3. Bereiten Sie in einer Durchstechflasche eine Lösung von Thiophenesulfonylchlorid (3,82 mmol des Sulfonylchlorids, 1 Äquivalent) in 5 ml THF vor.
   4. Die in Schritt 1.1.3 hergestellte Sulfonylchloridlösung wird zu der in Schritt 1.1.2 hergestellten Suspension gegeben und die resultierende Suspension weitere 30 Minuten gerührt.
   5. 20 ml VE-Wasser werden zu dem Reaktionsgemisch in dem 50-ml-Rundkolben gegeben.
   6. Der gesamte Inhalt des Reaktionskolbens mit Ausnahme des Rührstabs wird in einen 250-ml-Scheidetrichter¹⁰ überführt.
   7. Geben Sie 20 ml Ethylacetat (EtOAc) in den Scheidetrichter und schütteln Sie es.
   8. Die untere (wässrige) Schicht entfernen und beiseite stellen.
   9. Die oberste (organische) Schicht entfernen und in einem 200-ml-Erlenmeyerkolben beiseite stellen.
   10. Die wässrige Schicht wieder in den Scheidetrichter geben und mit 20 ml Ethylacetat extrahieren.
   11. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.8 und 1.1.9.
   12. Die kombinierten organischen Schichten werden wieder in den Scheidetrichter gegeben und mit 20 mL gesättigtem NaCl (Sole) gewaschen.
   13. Die untere (wässrige) Schicht entfernen und beiseite stellen.
   14. Die oberste (organische) Schicht wieder in den Erlenmeyerkolben abtropfen lassen.
   15. Die kombinierten organischen Schichten über MgSO₄ im Erlenmeyerkolben trocknen und mit qualitativem Filterpapier¹⁰ in einen 250 mL Rundkolben filtrieren.
   16. Entfernen Sie das organische Lösungsmittel auf einem Rotationsverdampfer.
2. Analysieren Sie das rohe Reaktionsgemisch mit ¹H NMR, um sicherzustellen, dass das Produkt¹⁰ gebildet hat.
   HINWEIS: Die für diesen Schritt erforderliche Zeit hängt davon ab, wie gut der Schüler mit der NMR-Spektroskopie vertraut ist.
3. Das Produkt wird durch Kieselgelsäulenchromatographie (10:1 Hexane: Ethylacetat) ^gereinigt10.
   HINWEIS: Dies kann in einer 3-stündigen Laborperiode abgeschlossen werden.
4. Charakterisieren Sie das Produkt spektroskopisch.
   HINWEIS: Die für diesen Schritt erforderliche Zeit hängt davon ab, wie gut der Schüler mit der NMR-Spektroskopie vertraut ist.
   HINWEIS: Charakterisierungsdaten für 3-Phenyl-1-(Thiophen-2-ylsulfonyl)-1H-pyrazol (PTSP)¹⁰:
   ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃ ): δ 8,11 (d, J = 2,8 Hz, 1H), 7,88 - 7,79 (m, 3H), 7,68 (dd, J = 5,0, 1,4 Hz, 1H), 7,44 - 7,31 (m, 3H), 7,07 (dd, J = 5,0, 3,9 Hz, 1H), 6,71 (d, J = 2,8 Hz, 1H).
   ¹³C NMR (101 MHz, CDCl ₃ ): δ 157,17, 136,84, 135,40, 135,36, 132,55, 131,28, 129,36, 128,72, 127,79, 126,47, 106,90.
   HRMS (ESI): Berechnet für C₁₃H₁₀O₂N₂NaS₂ [M+Na⁺]: 313.0076. Gefunden: 313.0078.

2. Strukturmodellierung zur Vorhersage der Bindung von Thiophenesulfonamiden an den Vibrio LuxR/HapR-Regulator

HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet die webbasierte Version von AutoDock Vina namens Webina¹¹ , um niedermolekulare Inhibitoren (in diesem Fall PTSP) in die Ligandenbindungstasche des LuxR/HapR-Homologs namens SmcR von Vibrio vulnificus¹² anzudocken. Die Ergebnisse dieses Protokolls sind (1) berechnete Bindungsaffinitäten und (2) eine Strukturdatei, die in PyMol oder einem verwandten Programm geöffnet werden kann, um die Liganden-Protein-Wechselwirkungen zu visualisieren. Dieses Protokoll kann für jedes kleine Molekül und jedes Protein mit einer Ligandenbindungstasche angepasst werden. Das Andocken an SmcR dauert Minuten, da der Suchbereich für diesen Rezeptor unten definiert ist. Wenn der Suchbereich für einen neuen Rezeptor definiert werden muss (Schritte 2.15-2.20), kann dies in einer 3-stündigen Laborperiode abgeschlossen werden. Sobald der Suchbereich definiert ist, dauert das anschließende Andocken nur wenige Minuten.

1. Laden Sie die AutoDock Tools herunter. Wählen Sie die entsprechende Datei für das Betriebssystem aus und installieren Sie sie auf dem Rechner.
   HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet eine webbasierte Version von AutoDock Vina. Das Andocken kann auch lokal durchgeführt werden, wenn dieses Programm installiert ist (siehe Anleitung des Herstellers).
2. Laden Sie die Struktur für apo SmcR herunter.
3. Navigieren Sie zur Proteindatenbank.
4. Geben Sie in der Suchleiste die PDB-ID 3KZ9 ein.
5. Klicken Sie im Dropdown-Menü in der oberen rechten Ecke der Seite auf Dateien herunterladen und wählen Sie das PDB-Format aus.
6. Nachdem Sie die Datei heruntergeladen haben, speichern Sie sie in einem neuen Ordner, der für die Docking-Arbeit vorgesehen ist.
7. Erstellen Sie eine .mol-Strukturdatei des Small Molecule Inhibitor (PTSP).
8. Navigieren Sie zu molview und klicken Sie auf das Mülleimersymbol, um die vorhandene Struktur zu entfernen.
9. Zeichnen Sie PTSP im Strukturfenster.
10. Klicken Sie auf 2D zu 3D.
11. Klicken Sie auf Extras → → MOL-Datei exportieren.
12. Eine Datei mit dem Titel "Molview.mol" wird auf den Computer heruntergeladen. Geben Sie der Datei einen sinnvollen Namen, und speichern Sie sie in dem Ordner, der die Protein-PDB-Datei enthält.
13. Definieren Sie den Suchbereich.
14. Definieren Sie den Bereich in Webina als Bindungstasche des Proteins (SmcR), um das Andocken in der richtigen Region zu erleichtern.
    HINWEIS: Koordinaten für SmcR werden mit dem folgenden Protokoll bereitgestellt und generiert. Wenn SmcR verwendet wird, können die Schritte 2.15-2.20 übersprungen werden. Das Protokoll kann für jedes Protein mit einer bekannten Ligandenbindungstasche angepasst werden. Koordinaten: center_x = 17, center_y = 40, center_z = 56, size_x = 12, size_y = 12, size_z = 12.
15. Klicken Sie in den AutoDock Tools auf Datei → Molekül lesen und öffnen Sie die in Schritt 2.5 heruntergeladene pdb-Proteindatei.
16. Navigieren Sie zum Dashboard und klicken Sie auf den blauen Pfeil neben dem Namen des Proteins. Daraufhin wird eine Liste von Ketten angezeigt. Klicken Sie auf den blauen Pfeil neben einer der Proteinketten.
17. Um die Aminosäuren der Bindungstasche hervorzuheben, suchen Sie die gewünschte Aminosäure in der angezeigten Liste. Gehen Sie neben der Aminosäure zu dem Dreieck in der Spalte Cl (Farbe) ganz rechts. Klicken Sie auf das Dreieck und wählen Sie nach Regenbogen aus.
    HINWEIS: Verwenden Sie diese Methode, um die folgenden Aminosäuren hervorzuheben: ¹² Phe75, Phe78, Leu79, Ile96, Met100, Trp114, Phe129, Asn133, Gln137, Val140, Ala163, Phe166, His167, Cys170 (Wenn Met100 fehlt, kann dies übersprungen werden).
18. Klicken Sie anschließend auf Grid → GridBox. Über der Proteinstruktur sollte ein Kästchen mit einer roten, grünen und blauen Fläche erscheinen. Bevor Sie Änderungen vornehmen, ändern Sie den Abstand (Angström) in 1. Dadurch wird sichergestellt, dass die Box für die nächsten Schritte korrekt skaliert ist.
    1. Ändern Sie dann die Drehregler für das mittlere Rasterfeld , um das Feld in x-, y- und z-Richtung zu verschieben und über den hervorgehobenen Aminosäuren zu platzieren. Klicken und ziehen Sie auf das Protein, um die Struktur in drei Dimensionen zu drehen.
       HINWEIS: Auf diese Weise können Sie sicherstellen, dass sich die Box in der richtigen Position befindet. Verwenden Sie bei Bedarf die oberen drei Zifferblätter für die Anzahl der Punkte, um die Größe des Feldes zu ändern.
19. Sobald die Position und die Abmessungen der Box eingestellt sind, klicken Sie auf Datei → Speichern aktuell schließen.
20. Klicken Sie im Menü auf Raster → Ausgabe → GPF speichern. Benennen Sie die Datei und speichern Sie sie im selben Ordner wie die beiden Strukturdateien. Diese GPF-Datei hat die Box-Koordinaten.
21. Führen Sie das "Andocken" in Webina durch, um eine berechnete Bindungsenergie zu erzeugen.
22. Öffnen Sie den Ordner, der die .mol-Ligandendatei und die .pdb-Proteindatei enthält. Webina benötigt .pdbqt-Dateien und führt die Dateikonvertierung durch.
23. Navigieren Sie zu Webina.
24. Rezeptor: Ziehen Sie den Mauszeiger über die von der PDB heruntergeladene Datei mit dem Namen 3kz9.pdb. Klicken Sie auf Wasserstoffatome hinzufügen und dann auf Konvertieren. Klicken Sie im nächsten Pop-up auf Ok , um mit einem Monomer zu arbeiten.
25. Ligand: Ziehen Sie den Mauszeiger über die .mol-Datei für PTSP (oder einen anderen niedermolekularen Inhibitor). Stellen Sie sicher, dass keine Kästchen ausgewählt sind, und klicken Sie auf Konvertieren. Lassen Sie "Richtige Pose" leer und scrollen Sie nach unten zur Docking Box. Geben Sie die entsprechenden Box-Parameter ein (entweder die oben für SmcR aufgeführten oder einen Satz, der vom Protokoll in den Schritten 2.15-2.20 für ein anderes Protein generiert wurde).
26. Klicken Sie auf Webina starten und warten Sie.
27. Eine Reihe von berechneten Bindungsenergien wird direkt unter einer Visualisierung des angedockten Moleküls angegeben [Affinität (kcal/mol)]. Stellen Sie sicher, dass der erste Wert der negativste ist.
28. Um den angedockten Liganden in pymol oder einem ähnlichen Programm zu visualisieren, laden Sie die Ausgabe-PDBQT-Datei herunter, indem Sie auf den entsprechenden Download-Button klicken. Diese Datei ist nur der Ligand (PTSP) in den angedockten Koordinaten.
29. Visualisieren Sie den angedockten Liganden-SmcR-Komplex in PyMol¹³.
    1. Laden Sie PyMol herunter und öffnen Sie es.
       HINWEIS: Vollzeitstudenten und Lehrkräfte können kostenlos eine PyMol-Lizenz erhalten. Wenn Sie nach dem ersten Start von PyMol nach einer Lizenz gefragt werden, klicken Sie auf Lizenz kaufen. Wählen Sie Schüler/Lehrer aus.
    2. Öffnen Sie die pdb-Datei mit dem Namen 3kz9.pdb.
    3. Öffnen Sie die von Webina erstellte pdbqt-Ausgabedatei.
    4. Visualisieren Sie die beste Konformation (die mit der geringsten Bindungsaffinität), indem Sie auf die kleinen nach vorne zeigenden Pfeile unten rechts auf dem PyMol-Bildschirm klicken. Die erste Bestätigung ist die günstigste und zeigt sich, wenn die Datei geöffnet wird.
    5. Manipulieren Sie das Protein mit dem angedockten Liganden in PyMol unter Verwendung von Standardbefehlen¹⁴.
       HINWEIS: In der vorherigen Studie von Newman et al. wurden die vorhergesagten Bindungsaffinitäten mehrerer von Webina bestimmter Verbindungen mit in vitro und in vivo Assays verglichen⁹. Diese Bindungsaffinitäten dienen als Referenz für Verbindungen, die wahrscheinlich gute Inhibitoren mit hohen Affinitäten (die mit niedrigeren kcal/mol-Zahlen korrelieren) für die Bindungstasche sind. Ein Beispiel für die Webina-Ausgabedaten ist in Abbildung 3A,B für die PTSP-Bindung in der Tasche von SmcR enthalten.

3. Biologische Bewertung von Thiophenesulfonamiden bei der Inhibition des Quorum Sensing

HINWEIS: Das Verfahren speziell für die Bestimmung des Vibrio campbellii-Proteins LuxR wird hier beschrieben. Dieses Verfahren kann jedoch für die Verwendung mit jedem der Vibrio LuxR/HapR-Proteine angepasst werden, die alle auf ektopisch replizierenden Plasmiden verfügbar sind, die mit dem Reporterplasmid pJV064^{kompatibel sind 9}. Der "Red-Green-Screen"-Assay wird in einem heterologen bakteriellen Hintergrund unter Verwendung von E. coli-Zellen durchgeführt, die die beiden Plasmide enthalten. Das LuxR/HapR-Expressionsplasmid (das Kanamycin-Resistenz verleiht) ist verfügbar, das verschiedene LuxR-Gene exprimiert (Abbildung 4A). Das pJV064-Plasmid (das Chloramphenicol-Resistenz verleiht) kodiert für ein gfp-Gen unter der Kontrolle eines LuxR-aktivierten Promotors und ein mCherry-Gen unter der Kontrolle eines LuxR-unterdrückten Promotors (Abbildung 4A). Beide Promotoren wurden aufgrund ihrer Identifizierung als LuxR-regulierte Gene mit großen Veränderungen in der Expression in vivo^{ausgewählt 15}. Die LuxR/HapR E. coli-Stämme und das Plasmid pJV064 wurden bereits veröffentlicht ^9,15.

1. Vorbereitung des flüssigen Mediums: Bereiten Sie 1 l LB-Medium vor.
   1. Wiegen Sie 10 g NaCl, 10 g Bactotrypton und 5 g Hefeextrakt ab.
   2. Mischen Sie die Komponenten in einem Becherglas oder Messzylinder mit einer Rührplatte.
   3. Bringen Sie das Gesamtvolumen mit Messzylindern auf 1 l.
   4. Falls gewünscht, aliquotieren Sie vor dem Autoklavieren in 100 mL pro Flasche.
   5. 15 Minuten pro 1 l Medium autoklavieren. Wenn kein Autoklav verfügbar ist, kann alternativ ein Instant Pot verwendet werden¹⁶.
2. Stamminokulation (Tag 1)
   1. Geben Sie Antibiotika in Endkonzentrationen von Kanamycin (40 μg/ml) und Chloramphenicol (10 μg/ml) in das LB-Medium.
   2. Aliquotieren Sie 5 mL des Mediums LB/Kan40/CM10 in sterile Reagenzgläser mit Kappen.
   3. Inokulieren Sie E. coli-Stämme aus Gefrierbeständen: E. coli-Kultur, die LuxR/HapR und pJV064-Plasmid (LuxR+⁾ exprimiert9,15; Kontrollkultur des leeren Vektors von E. coli und pJV064-Plasmid (LuxR-)^9,15.
   4. Schütteln Sie die Kultur über Nacht bei 275 U/min bei 30 °C für 16-18 h.
3. Assay von Thiophenesulfonamiden (Tag 2)
   1. Wiegen Sie ~30 mg der Verbindung ab. Resuspendieren auf 100 mM in DMSO und Vortex zum Mischen. Bereiten Sie als Nächstes eine 10 mM Brühe vor.
   2. Mischen Sie 20 μl des 100 mM-Stoffes mit 180 μl DMSO, um ihn zu verdünnen (1:10), um einen Arbeitsstoff von 10 mM zu erhalten. Vortex zum Mischen.
   3. LuxR+-Kultur und LuxR-Kulturen (1:100) in 10 mL LB/Kan/CM-Medien in konische 15-ml-Röhrchen rückverdünnen und kurz vortexen, um sie zu mischen.
   4. Verwenden Sie für den Assay eine sterile 96-Well-Platte mit schwarzem Well, klarem Boden.
   5. Bereiten Sie eine Verdünnungsreihe für alle Säulen vor. Als Referenz ist ein Diagramm der 4-fachen Verdünnungsreihe beigefügt (Abbildung 4B).
      HINWEIS: Für diesen Vorgang wird eine digitale Mehrkanalpipette empfohlen. Diese Methode ist für eine 4-fache Verdünnungsreihe (1:4) ausgelegt. Es können jedoch auch andere Verdünnungsreihen verwendet werden (z. B. 1:10, 1:5).
      1. Pipettieren Sie 200 μl der LuxR+-Kulturmischung in eine 96-Well-Platte in Reihe A, 1-6 (Abbildung 4B; grün).
      2. Pipettieren Sie 200 μl der LuxR-Kulturmischung in eine 96-Well-Platte in Reihe A, 7-12 (Abbildung 4B; orange).
      3. Pipettieren Sie 150 μl der LuxR+-Kulturmischung in eine 96-Well-Platte in den Reihen B-E, 1-6 (Abbildung 4B; grün).
      4. Pipettieren Sie 150 μl der LuxR-Kulturmischung in eine 96-Well-Platte in den Reihen B-E, 7-12 (Abbildung 4B; orange).
      5. Geben Sie 2 μl der Verbindung oder des DMSO in jede Vertiefung von Reihe A gemäß Abbildung 4B.
      6. Pipettieren Sie für jede Säule 3 Mal nach oben und unten und übertragen Sie dann 50 μl von Reihe A in Reihe B in dieselbe Säule.
      7. Wiederholen Sie das Mischen und Pipettieren für die Reihen B, C, D, E. Nach dem Mischen von Reihe E werden 50 μL entnommen und in den Abfall gegeben. Am Ende sollte man 150 μL in jeder Vertiefung haben.
   6. Decken Sie die Platte mit mikroporösem Klebeband ab.
   7. Inkubieren Sie die Platte, indem Sie sie bei 275 U/min bei 30 °C über Nacht 16-18 h lang schütteln.
   8. Messen Sie die Fluoreszenz und optische Dichte der Assay-Platten (Tag 3).
      1. Entfernen Sie das Klebeband vorsichtig und verschütten Sie keine Flüssigkeit aus den Vertiefungen.
      2. Lesen Sie auf einem Plattenlesegerät die optische Dichte bei 600 nm (OD₆₀₀), GFP und mCherry.
         HINWEIS: Es wird eine festgelegte Verstärkung für beide Fluoreszenzkanäle empfohlen, um Vergleiche zwischen den Assays zu ermöglichen.
   9. Zeichnen Sie die Daten als normalisierte Fluoreszenz pro Zelle auf: GFP/OD₆₀₀ und mCherry/OD₆₀₀.
   10. Stellen Sie die Daten wie in Abbildung 5 dargestellt grafisch dar, um die Ergebnisse für die DMSO-Kontrolle im Vergleich zu den Testproben zu veranschaulichen.

4. Waschen der schwarzen Assay-Platten zur Wiederverwendung

1. Tränken Sie die Teller in Bleichmittel.
   1. Kennzeichnen Sie ein 1-Liter-Kunststoffbecherglas als "biologischer Abfall". Schütten Sie Flüssigkeit von Platten in diesen Abfallbehälter (entfernen Sie vorsichtig alle Tropfen mit 70% EtOH). Spülen Sie die Platten mit DI-Wasser aus der Spritzflasche über den Abfall und kippen Sie ihn hinein.
   2. Beschriften Sie einen weiteren 1-Liter-Kunststoffbecher mit "30 % Bleichmittel". Legen Sie die Teller/Deckel in diesen Behälter und bedecken Sie sie mit 30% Bleichmittel. Wickeln Sie die Oberseite mit einer Plastikfolie ein und wiegen Sie die Teller mit einer Trinkgelddose oder ähnlichem. Über Nacht in die Bleichlösung eintauchen lassen.
2. Spülen und in Ethanol einweichen.
   1. Spülen Sie die Platten gründlich mit DI-Wasser in das Waschbecken ab, damit kein Bleichmittel zurückbleibt. Schütten Sie das restliche Wasser aus den Brunnen in die Spüle.
   2. Geben Sie 70% EtOH mit einer Sprühflasche in alle Vertiefungen und Deckel. Lassen Sie die Platten aufrecht stehen, mit dem Deckel nach oben, aber schief, damit das EtOH verdampfen kann, aber nichts in die Vertiefungen fällt. Lassen Sie den Teller über Nacht ruhen.
3. Lassen Sie die Platten trocknen.
   1. Schütten Sie das restliche EtOH aus.
   2. Drehen Sie den Teller auf ein Papiertuch und lassen Sie den Rest des EtOH verdampfen. Lassen Sie die Platten auf diese Weise in einem Abzug. Die Platten sind bereit für den nächsten Einsatz.

Ergebnisse

Als repräsentative Ergebnisse sind Daten von drei Thiophenesulfonamid-Verbindungen enthalten, die von Studenten für die Verbindungen 1A, 2B und 3B synthetisiert wurden (Abbildung 5A-C; ausführlich beschrieben in Newman et al.⁹). Jede Verbindung wurde im E. coli-Stamm getestet, der V. campbellii LuxR exprimierte, und unter Verwendung des Reporterplasmids pJV064. Die normie...

Diskussion

Dieses CURE wurde ursprünglich als verkürztes zweistufiges, dreiwöchiges Protokoll (Design/Synthese und Assay) entwickelt und in fünf Semestern im Rahmen eines organischen Praktikums der Oberstufe^{implementiert 8}. Seit dem ursprünglichen Bericht wurde das Computermodellierungsmodul hinzugefügt und der E. coli-Assay für unerfahrene Forscher optimiert. Das daraus resultierende dreistufige, zweisemestrige Protokoll wurde dreimal im Rahmen des Arts and ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-thiophensulfonyl chloride	Ambeed	A258464
3-Phenyl-1H-pyrazole	Ambeed	A104401	98%
96-well clear bottom black plates	USA Scientific	5665-5090Q	96-well polystyrene uClear black TC plate with lid, clear flat bottom, sterile, 8/sleeve, 32/case
Autodock Tools			http://mgltools.scripps.edu/downloads
Autodock Vina			https://vina.scripps.edu
Chloramphenicol
DMSO
ethyl acetate	Fisher Scientific	AA31344M4	Reagent grade
hexanes	Fisher Scientific	H291
Kanamycin
magnesium sulfate	Fisher Scientific	M65-500	Anhydrous
Microporous Film	USA Scientific	2920-1010	Microporous Film, -20degC to +80degC, 50/box, Sterilized
molview			molview.org
NaCl
Protein Databank			https://www.rcsb.org/
Pymol			https://pymol.org/2/
Qualitative filter paper	Fisher Scientific	09-805-342	Cytiva Whatman™ Qualitative Filter Paper: Grade 1 Circles, 47 mm
Silica gel	Sorbtech	30930M-25	Silica Gel, Standard Grade, 60A, 40-63um (230 x 400 mesh)
Sodium hydride	Millipore Sigma	452912	60 % dispersion in mineral oil
Tetrahydrofuran	Fisher Scientific	MTX02847	Tetrahydrofuran, anhydrous, 99.9%, ACS Grade, DriSolv
TLC Plates	Sorbtech	1634067	Silica gel TLC plates, aluminum backed
Tryptone
webina			https://durrantlab.pitt.edu/webina/
Yeast Extract