In-vitro-Kultivierungstechnik zur Untersuchung der zellulären Dynamik in Zebrafischschuppen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Untersuchung der zellulären Dynamik mit einer einfachen In-vitro-Kulturtechnik . Es bietet Zebrafischforschern und Pädagogen die Möglichkeit, zelluläre Prozesse, wie z. B. solche, die mit der Knochenhomöostase und der grundlegenden Zellbiologie zusammenhängen, zu untersuchen, indem fluoreszierende Zellkerne und apoptotische Zellen innerhalb der Skalen sichtbar gemacht werden.

Zusammenfassung

Zebrafischschuppen bieten eine Vielzahl von Vorteilen für den Einsatz in Standardlaboren für Lehr- und Forschungszwecke. Die Schuppen lassen sich leicht und ohne Euthanasie sammeln, regenerieren sich innerhalb weniger Wochen und sind durchscheinend und klein, so dass sie mit einem Standardmikroskop betrachtet werden können. Zebrafischschuppen sind besonders nützlich in Bildungsumgebungen, da sie den Schülern eine einzigartige Gelegenheit bieten, praktische Lernerfahrungen zu machen, insbesondere im Verständnis der Zelldynamik und der In-vitro-Kultivierungsmethoden . Das Hauptziel dieses Protokolls besteht darin, eine Methode zur Entnahme und Konservierung von Zebrafischschuppen in Kultur zu beschreiben, die in einer Vielzahl von biologischen Studien unter Verwendung grundlegender Laborgeräte verwendet werden kann. Darüber hinaus beschreibt das Protokoll ihre Verwendung zum Verständnis der Knochenhomöostase durch die Untersuchung der Aktivität von Knochenzellen, die an der Knochenresorption und -ablagerung beteiligt sind. Es enthält auch zusätzliche Protokolle für allgemeine Techniken, wie z. B. die Visualisierung von Zellkernen und apoptotischen Zellen. Das In-vitro-Kultivierungsprotokoll liefert zuverlässige Ergebnisse mit minimalen Reagenzien und Geräten. In diesem Artikel werden die Vorteile der Verwendung von In-vitro-Kulturen von Zebrafischschuppen zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung diskutiert und die Ressourcen skizziert, die zur Unterstützung ihrer Integration in Bildungseinrichtungen erforderlich sind.

Einleitung

In den letzten Jahren hat sich der Zebrafisch (Danio rerio) zu einem wertvollen Modellorganismus in verschiedenen wissenschaftlichen Bereichen entwickelt, darunter Genetik, Entwicklungsbiologie und Toxikologie ^1,2,3. Zebrafische sind kleine tropische Süßwasserfische, die in den Flüssen Südostasiens beheimatet^{sind 4}. Sie sind aufgrund ihrer einfachen Pflege, ihrer geringen Größe, ihres schnellen Fortpflanzungszyklus und ihrer durchscheinenden Embryonen zu einem beliebten Modellorganismus in der Biologie geworde....

Protokoll

Alle hier beschriebenen Protokolle folgen den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care und wurden jährlich vom Tierpflegeausschuss der Saint Mary's University/Mount Saint Vincent University unter den Protokollnummern 20-14 und 21-12 genehmigt. Vor der Durchführung dieses Protokolls müssen die Anwender sicherstellen, dass die Richtlinien des Bundes und der Länder zur Verwendung von Tieren in Forschung und Lehre befolgt werden²³. Die Einzelheiten zu den in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereit....

Diskussion

Zebrafischschuppen sind ein leicht zugängliches In-vitro-Modell zur Untersuchung einer Vielzahl verschiedener biologischer Prozesse, die mit einer Kultivierungsmethode und einem Inkubator zur Simulation ihrer natürlichen Umgebung bis zu 2 Tage lang aufrechterhalten werden können¹¹. Die Waagen haben eine regelmäßige und proportionale Verteilung der vorhandenen Zellen, was es den Forschern ermöglicht, Zellen zu betrachten, zu zählen und zu markieren .......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL tubes	n/a	n/a
37% HCl	EMD	HX0603-4	For pH stabilization and prepration of PRS
Concave slide	n/a	n/a
DAPI	Vectashield	H-1200	For cell nuclei visualization
Diazonium salt (Fast Blue B)	Sigma	D9805	For AP substrate solution
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder	Sigma	D5523	For scale culture media
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS222)	Sigma	E10521	For preparation of 0.1% MS222
Fetal bovine serum	Sigma	F4135	For scale culture media
Fluorescence microscope	n/a	n/a
Glacial acetic acid	Fisher	A38 212	For acetate buffer
Glycerol	VWR	BDH1172-4LP	For 80% glycerol - storage scales
HEPES	ThermoFisher	15630106	For scale culture media
Hot plate	n/a	n/a
KCl	Sigma	P217-10	For preparation of PBS
Lysotracker	ThermoFisher	L7528	For lysosomes  visualization
Maleic acid	Sigma	M0375	For Tris-Maleate buffer
Micropipette	n/a	n/a
N,N-dimethylformamide	Sigma	319937	For AP substrate solution
N,N-dimethylformamide	Sigma	319937	For Enzyme Substrate Solution
Na2HPO4	EMD	SX0720-1	For preparation of PBS
NaCl	Sigma	S9888	For preparation of PBS
NaNO2	Sigma	S-2252	For 4% NaNO2
NaOH	Sigma	S5881	For preparation of 4% PFA
NaOH	Sigma	S5881	For scale fixation and pH stabilization
Napthol-AS-TR-phosphate	Sigma	N6125	For AP substrate solution
Napthol-AS-TR-phosphate	Sigma	N6125	For Enzyme Substrate Solution
Pararosaniline hydrochloride	Sigma	P3750	For PRS
Penicillin-streptomycin 5000 units penicillin and 5mg streptomyocin/ml	ThermoFisher	15140122	For scale culture media
Personal protective equipment (PPE): disposable nitrile gloves, safety glasses/splash goggles and lab coat.	n/a	n/a
PFA	Sigma	P6148	For scale fixation
Sodium acetate	Sigma	S2889	For acetate buffer
Standard compound microscope	n/a	n/a
Stir plate	n/a	n/a
Tartaric acid	Sigma	T6521	For Tartrate buffer
Tris base	Roche	03 118 142 001	For Tris-Maleate buffer