Transfektion eines molekularen Klons von Naegleria gruberi rDNA in N. gruberi Trophozoiten

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Transfektion von Naegleria gruberi Trophozoiten mit einem Konstrukt, das während der gesamten passagierenden Trophozoiten in vitro sowie durch Enzystierung und Exzystierung erhalten bleibt.

Zusammenfassung

Alle ribosomalen Gene von Naegleria trophozoiten werden in einem geschlossenen zirkulären extrachromosomalen ribosomalen DNA (rDNA) enthaltenden Element (CERE) aufrechterhalten. Während wenig über CERE bekannt ist, zeigt eine vollständige Genomsequenzanalyse von drei Naegleria-Spezies eindeutig, dass es im Kerngenom keine rDNA-Cistronen gibt. Darüber hinaus wurde ein einzelner DNA-Replikationsursprung im N. gruberi CERE kartiert, was die Hypothese unterstützt, dass CERE unabhängig vom Kerngenom repliziert. Diese CERE-Eigenschaft deutet darauf hin, dass es möglich sein könnte, manipuliertes CERE zu verwenden, um fremde Proteine in Naegleria trophozoites einzuführen. Als ersten Schritt zur Erforschung der Verwendung eines CERE als Vektor in Naegleria haben wir ein Protokoll zur Transfektion von N. gruberi mit einem molekularen Klon von N. gruberi CERE entwickelt, der in pGEM7zf+ (pGRUB) kloniert wurde. Nach der Transfektion konnte pGRUB in N. gruberi Trophozoiten für mindestens sieben Passagen sowie durch Enzystierung und Exzystierung leicht nachgewiesen werden. Als Kontrolle wurden Trophozoiten mit dem Rückgratvektor pGEM7zf+ ohne die N. gruberi-Sequenzen (pGEM) transfiziert. pGEM wurde nach der ersten Passage nach der Transfektion in N. gruberi nicht nachgewiesen, was auf seine Unfähigkeit zur Replikation in einem eukaryotischen Organismus hinweist. Diese Studien beschreiben ein Transfektionsprotokoll für Naegleria trophozoiten und zeigen, dass die bakterielle Plasmidsequenz in pGRUB die erfolgreiche Transfektion und Replikation des transfizierten CERE-Klons nicht hemmt. Darüber hinaus wird dieses Transfektionsprotokoll entscheidend für das Verständnis der minimalen Sequenz des CERE sein, die seine Replikation in Trophozoiten antreibt, sowie für die Identifizierung regulatorischer Regionen in der nicht-ribosomalen Sequenz (NRS).

Einleitung

Die Gattung Naegleria umfasst über 45 Arten, obwohl es unwahrscheinlich ist, dass alle Vertreter der Art identifiziert wurden¹. Naegleria kann in verschiedenen Formen existieren: als Trophozoiten (Amöben), als Flagellaten oder, wenn die Ressourcen stark begrenzt sind, als Zysten 1,2,3,4. Die Gattung Naegleria ist bekannt für ihre eine besonders gefährliche Art, Naegleria fowleri, bekannt als "die gehirnfressende Amöbe" (besprochen in 1,2,3,4,5,6,7)....

Protokoll

Die Einzelheiten zu den Spezies, Reagenzien und Geräten, die in dieser Studie verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt. Die Sequenz des pGRUB-Konstrukts mit 17.004 Basenpaaren ist in der Zusatzdatei 1 enthalten.

1. Trophozoiten züchten

1. Gefrorene Trophozoiten von N. gruberi bei 37 °C 3 Min. auftauen.
2. Trophozoiten werden in T25-Kolben in modifiziertem Pepton/Hefeextrakt/Nukleinsäure/Folsäure/Hämin mit 10 % fötalem Kälberserum (PYNFH)-Medium plus 2 % Puffer (Dinatriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat) inokuliert.
3. Kultivieren Sie die Troph....

Diskussion

Das hierin skizzierte Protokoll ist sehr einfach, obwohl jedes Konstrukt wahrscheinlich einen gewissen Grad an Optimierung erfordert, insbesondere des DNA-Transfektionsreagenz-Verhältnisses, abhängig von der Art des Konstrukts und der verwendeten Naegleria-Spezies . Wir haben nur ein kommerziell erhältliches Transfektionsreagenz mit diesem Protokoll getestet, aber es ist wahrscheinlich, dass mehrere andere wirksam sein können. Da ein vollständiger Klon des CERE verwendet wird, der einen funktionellen Urspru.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Bio Rad	161-3102
Ammonium Acetate	Sigma Aldrich	A-7330
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C-4901
Crushed ice
Culture Flasks, T-75	Thermo Scientific	130190
Culture Plate, 6-well	Corning	3506
DNAse	Sigma Aldrich	D-4527
EDTA, 0.5 M	Affymetrix	15694
Electropheresis Gel Apparatus	Amersham Biosciences	80-6052-45
Eppendorf Tubes, 1.5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
Eppendorf Tubes, 2 mL	Fisher Scientific	05-408-138
Ethanol, 100%	Decon Laboratories	2716
Ethidium Bromide	Sigma Aldrich	E-8751
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140
Folic Acid	Sigma Aldrich	F7876-25G
GeneRuler 1 kb Plus Ladder	Thermo Scientific	SM1331
Glacial Acetic Acid	Fisher Scientific	UN2789
GoTaq Green PCR Master Mix	Promega	M7122
Heating Block	Thermo Scientific	88871001
Hemacytometer	Hausser Scientific	1483
Hemin	Sigma Aldrich	51280
Iron Chloride	Sigma Aldrich	372870-256
Ligase	NEB	M2200S
Magneisum Chloride	Fisher Scientific	M33-500
Microfuge	Thermo Scientific	MySpin 12
Microscope	Nikon	TMS
N. gruberi	ATCC	30224
Nucleic Acid	Chem Impex Int’l	#01625
Peptone	Gibco	211677
pGEM	Promega	P2251
Potassium Phosphate	Sigma Aldrich	P0662-500G
PowerPac HC Electropharesis Power Supply Unit	Bio Rad	1645052
Sodium Chloride	MCB Reagents	SX0420
Sodium Phosphate, dibasic	Sigma Aldrich	S2554
Tabletop Centrifuge	eppendorf	5415R
Tris, base	Sigma Aldrich	T1503-1KG
Trypan Blue, 0.4%	Gibco	15250-061
ViaFect Reagent	Promega	E4981
Weigh Scale	Denver Instruments	APX-60
Yeast Extract	Gibco	212750