Transfektion eines molekularen Klons von Naegleria gruberi rDNA in N. gruberi Trophozoiten

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Transfektion von Naegleria gruberi Trophozoiten mit einem Konstrukt, das während der gesamten passagierenden Trophozoiten in vitro sowie durch Enzystierung und Exzystierung erhalten bleibt.

Zusammenfassung

Alle ribosomalen Gene von Naegleria trophozoiten werden in einem geschlossenen zirkulären extrachromosomalen ribosomalen DNA (rDNA) enthaltenden Element (CERE) aufrechterhalten. Während wenig über CERE bekannt ist, zeigt eine vollständige Genomsequenzanalyse von drei Naegleria-Spezies eindeutig, dass es im Kerngenom keine rDNA-Cistronen gibt. Darüber hinaus wurde ein einzelner DNA-Replikationsursprung im N. gruberi CERE kartiert, was die Hypothese unterstützt, dass CERE unabhängig vom Kerngenom repliziert. Diese CERE-Eigenschaft deutet darauf hin, dass es möglich sein könnte, manipuliertes CERE zu verwenden, um fremde Proteine in Naegleria trophozoites einzuführen. Als ersten Schritt zur Erforschung der Verwendung eines CERE als Vektor in Naegleria haben wir ein Protokoll zur Transfektion von N. gruberi mit einem molekularen Klon von N. gruberi CERE entwickelt, der in pGEM7zf+ (pGRUB) kloniert wurde. Nach der Transfektion konnte pGRUB in N. gruberi Trophozoiten für mindestens sieben Passagen sowie durch Enzystierung und Exzystierung leicht nachgewiesen werden. Als Kontrolle wurden Trophozoiten mit dem Rückgratvektor pGEM7zf+ ohne die N. gruberi-Sequenzen (pGEM) transfiziert. pGEM wurde nach der ersten Passage nach der Transfektion in N. gruberi nicht nachgewiesen, was auf seine Unfähigkeit zur Replikation in einem eukaryotischen Organismus hinweist. Diese Studien beschreiben ein Transfektionsprotokoll für Naegleria trophozoiten und zeigen, dass die bakterielle Plasmidsequenz in pGRUB die erfolgreiche Transfektion und Replikation des transfizierten CERE-Klons nicht hemmt. Darüber hinaus wird dieses Transfektionsprotokoll entscheidend für das Verständnis der minimalen Sequenz des CERE sein, die seine Replikation in Trophozoiten antreibt, sowie für die Identifizierung regulatorischer Regionen in der nicht-ribosomalen Sequenz (NRS).

Einleitung

Die Gattung Naegleria umfasst über 45 Arten, obwohl es unwahrscheinlich ist, dass alle Vertreter der Art identifiziert wurden¹. Naegleria kann in verschiedenen Formen existieren: als Trophozoiten (Amöben), als Flagellaten oder, wenn die Ressourcen stark begrenzt sind, als Zysten 1,2,3,4. Die Gattung Naegleria ist bekannt für ihre eine besonders gefährliche Art, Naegleria fowleri, bekannt als "die gehirnfressende Amöbe" (besprochen in 1,2,3,4,5,6,7), die die Ursache der fast überall tödlichen primären Amöben-Meningoenzephalitis ist.

Naegleria kodieren ihre rDNA auf dem CERE, das sich im Nukleolus befindet. Die vollständige Sequenzierung des Genoms von drei Naegleria-Spezies bestätigt das Fehlen von rDNA im Kerngenom 8,9,10,11. Basierend auf den begrenzten CERE-Sequenzen in voller Länge reicht die CERE-Sequenz von etwa 10 kbp bis 18 kbp Länge. CERE jeder Naegleria-Spezies tragen jeweils ein einzelnes rDNA-Cistron (mit der ribosomalen 5,8-, 18- und 28S-DNA) auf jeweils etwa 4.000 CERE pro Zelle 12,13,14. Abgesehen von rDNA verfügt jede CERE über eine große Nicht-rDNA-Sequenz (NRS). Die CERE-Größen variieren zwischen den Arten; Die Unterschiede sind hauptsächlich auf die unterschiedliche Länge der NRS zurückzuführen, da die rDNA-Sequenzen in der Gattung 1,15,16,17,18,19,20 hoch konserviert sind. Die Kartierung eines einzigen Ursprungs der DNA-Replikation innerhalb des N. gruberi CERE NRS²¹ unterstützt die Hypothese, dass Naegleria CERE unabhängig vom Kerngenom repliziert.

N. gruberi ist eine nicht-pathogene Amöbe, die häufig zur Untersuchung der Biologie von Naegleria verwendet wird. Wir haben eine Methodik zur Transformation von N. gruberi Trophozoiten mit einem CERE-Klon der gleichen Spezies entwickelt, um die Hypothese zu testen, dass Naegleria amoebae CERE innerhalb der Trophozoiten tolerieren und unabhängig voneinander replizieren. Dies wurde erreicht, indem N. gruberi mit einem Volllängenklon von N. gruberi CERE in Trophozoiten umgewandelt und das Schicksal des Spender-CERE-Klons mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verfolgt wurde. Einen allgemeinen Überblick über das Protokoll gibt Abbildung 1. Die hierin präsentierten Daten zeigen, dass der Spenderklon durch mindestens sieben Passagen in der Gewebekultur nachgewiesen werden kann, sowie durch Enzystierung und Exzystierung aufrechterhalten werden kann. Diese Studien bilden die Grundlage für ein Mittel, um zu analysieren, wie sich CERE repliziert, und um seine Verwendung als Vektor zur Transfektion von Naeglerien zu untersuchen.

Protokoll

Die Einzelheiten zu den Spezies, Reagenzien und Geräten, die in dieser Studie verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt. Die Sequenz des pGRUB-Konstrukts mit 17.004 Basenpaaren ist in der Zusatzdatei 1 enthalten.

1. Trophozoiten züchten

1. Gefrorene Trophozoiten von N. gruberi bei 37 °C 3 Min. auftauen.
2. Trophozoiten werden in T25-Kolben in modifiziertem Pepton/Hefeextrakt/Nukleinsäure/Folsäure/Hämin mit 10 % fötalem Kälberserum (PYNFH)-Medium plus 2 % Puffer (Dinatriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat) inokuliert.
3. Kultivieren Sie die Trophozoiten bei 25 °C bis ~80% konfluent, wo sie eine amöboide Morphologie aufweisen (Abbildung 2A).
   HINWEIS: Bei der anfänglichen Wiederbelebung einer Kultur von Trophozoiten aus ihrem gefrorenen Zustand kann es bis zu 5-7 Tage dauern, bis ein T25 konfluent wird. Dekantieren Sie die Medien alle 3-4 Tage und ersetzen Sie sie durch frische Medien.
4. Legen Sie die konfluenten Kolben für 5-10 min auf Eis, um die anhaftenden Trophozoiten aus dem Kunststoff zu lösen. Den Kolben vorsichtig schwenken, um alle verbleibenden anhaftenden Zellen zu entfernen. Die Trophozoiten haben nun eine "aufgerundete" Morphologie (Abbildung 2B).
5. Teilen Sie die Kulturen 1:2 bis 1:4 in neue Gewebekulturflaschen auf.
6. Entfernen Sie das PYNFH und ersetzen Sie es durch sterile Zystenmedien (120 mM Natriumchlorid, 0,03 mM Magnesiumchlorid, 1 mM Dinatriumphosphat, 1 mM Kaliumdihydrogenphosphat, 0,03 mM Calciumchlorid, 0,02 mM Eisenchlorid, pH 6,8)²² , um das N. gruberi zu enzysten.
   HINWEIS: Die Mehrzahl der Trophozoiten wird nach 72 h enzystiert (Abbildung 2C). Die Exzystierung sollte innerhalb von 72 Stunden abgeschlossen sein.
7. Entfernen Sie die Zysten aus den Kolben, zentrifugieren Sie sie 10 Minuten lang bei 20 °C bei 600 x g und resuspendieren Sie die Zysten in PYNFH-Medien mit 10 % fötalem Kälberserum, um die Zellen zu exzysten. Bei 25 °C 24 h inkubieren, bis die Trophozoiten zu schlüpfen beginnen.

2. Transfizierende Trophozoiten

1. Die Trophozoiten werden in eine 6-Well-Gewebekulturplatte mit flachem Boden (1 ml von 1 x 10⁶ Trophozoiten/ml) überführt und bei 25 °C kultiviert.
2. Transfizieren Sie die Zellen, wenn sie 70 %-80 % konfluent erreichen (~10,4 x 10⁴ Zellen/^cm2 in 6-Well-Clustern). Erwärmen Sie das Transfektionsreagenz vor Gebrauch auf Raumtemperatur.
3. Bereiten Sie das Plasmid-Transfektions-Reagenzgemisch wie folgt vor: 75 ng Plasmid-DNA und 0,225 μl des Transfektionsreagenzes in 200 μl PYNFH-Medien ohne FBS. Bereiten Sie eine ausreichende Plasmid-Transfektions-Reagenzmischung vor, um die Transfektion in doppelter Ausführung durchzuführen.
   HINWEIS: In dieser Studie wurde ein bakterielles Plasmid verwendet, das einen Klon von N. gruberi CERE (pGRUB) in voller Länge enthält. Als Negativkontrolle wurde ein leeres Plasmid (pGEM) verwendet (Abbildung 3).
4. Das Plasmid-Transfektions-Reagenzgemisch wird 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
5. Entfernen Sie ~800 μL Medium aus den Trophozoiten-Monoschichten kurz vor der Transfektion.
6. Geben Sie das Plasmid-Transfektions-Reagenzgemisch auf die Trophozoiten.
7. Schwenken Sie die Platte alle 15 Minuten vorsichtig, um zu verhindern, dass sich das Medium an den Rändern der Platte ansammelt.
8. Waschen Sie die Monolayer einmal mit 2 mL Wachstumsmedium nach 1 h Inkubation bei 25 ^°C.
9. Behandeln Sie die Monolayer mit 10 U DNase in 1 mL 10x DNase Puffer für 15 min bei 37 °C, um restliche Plasmid-DNA zu entfernen, waschen Sie sie einmal mit Wachstumsmedium, fügen Sie 2 mL frisches Medium hinzu und stellen Sie sie bei 25 °C. Inkubieren Sie die Platte 24-36 Stunden lang.
10. Lege die Platte für 10 Minuten auf Eis, um die Zellen freizusetzen.
11. Teilen Sie eine Vertiefung (1:2) in zwei neue Vertiefungen auf.
12. Sammle Trophozoiten aus den verbleibenden Vertiefungen zu Versuchszwecken.
    HINWEIS: Alle Kulturen werden doppelt ausgeführt. Für jede Bedingung wird 1 Vertiefung für den Durchgang und 1 für die CERE-Isolierung verwendet.

3. Isolierung von CERE und Naegleria

1. Berechnen Sie die Anzahl der Trophozoiten in jeder Vertiefung, die für die CERE-Isolierung verwendet wird, durch Trypanblau-Ausschlussfärbung und ein Hämozytometer²³.
2. Legen Sie die Trophozoiten in ein 2,0-ml-Röhrchen.
3. Waschen Sie die Trophozoiten einmal in 100 mM Natriumchlorid (pH 7,5) durch Zentrifugation (600 x g, 10 min, 4 °C).
   HINWEIS: Natriumchlorid verhindert, dass die Trophozoiten an den Seiten des Röhrchens haften bleiben.
4. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellpellets in 100 μl 100 mM EDTA (pH 7,5).
5. Legen Sie das Röhrchen für 15 min bei 98 °C in einen Wärmeblock, um die Zellen zu lysieren und die Enzyme in den Trophozoiten zu inaktivieren.
   HINWEIS: Dieser Schritt inaktiviert DNasen, die in Naegleria trophozoites reichlich vorhanden sind. DNasen können die Fähigkeit beeinträchtigen, natives CERE und den molekularen Klon in Schritt 4 nachzuweisen. Die DNA-Ausbeute wird verringert, wenn in Schritt 3.4 mehr als ~3 x 10⁶ Zellen verwendet werden.
6. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei Höchstgeschwindigkeit (16.000 x g) bei 4 °C für 10 Minuten, um den Schmutz zu pelletieren.
7. Übertragen Sie die Überstände in ein neues Röhrchen.
8. Ethanol fällt die Überstände mit 0,5 Volumen 7,5 M Ammoniumacetat (pH 7,5), 3 Volumen absolutem Ethanol und 1 μl 10 mg/ml Glykogen als Träger aus.
9. Drehen Sie das Rohr mehrmals um und stellen Sie es mindestens 1 h oder über Nacht bei -80 °C auf.
10. Erwärmen Sie die Proben auf Raumtemperatur.
11. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei Raumtemperatur für 10 min bei 16.000 x g.
12. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet mit 70%igem Ethanol durch Zentrifugation für 5 min bei 16.000 x g (bei Raumtemperatur).
13. Entfernen Sie das Ethanol und trocknen Sie das Pellet 5 Minuten lang an der Luft.
14. Resuspendieren Sie das getrocknete Pellet in sterilem deionisiertem (DI) Wasser. Normalisieren Sie das Volumen auf 10.000 Trophozoiten pro μl.
15. Bis zur Verwendung in der PCR bei -80 °C lagern.

4. PCR-Nachweis von transformierten Trophozoiten

1. Verwenden Sie 20.000 Zelläquivalente DNA, 600 nM-Primer (Tabelle 1) und Taq-Polymerase und führen Sie die PCR²⁴ durch.
   HINWEIS: Primer, die zwischen nativem CERE und kloniertem CERE unterscheiden, sind in Tabelle 1 aufgeführt, ebenso wie die PCR-Bedingungen. Abbildung 3 zeigt die Position der Primer auf den Konstrukten. Die PCR erfordert eine Optimierung in Abhängigkeit von den verwendeten Primern sowie dem verwendeten spezifischen PCR-Mix.
2. Mikrowelle 0,8% Agarose in 1x Trisbase, Essigsäure und EDTA (TAE) Puffer, bis die Agarose aufgelöst ist.
3. Die Agarose auf ~50 °C bei Raumtemperatur abkühlen lassen.
4. Gießen Sie die Lösung in eine Gelgießschale, die einen Kamm enthält, um Vertiefungen zu bilden.
5. Lassen Sie das Gel bei Raumtemperatur ruhen, bis es fest ist.
6. Legen Sie das Gel in das Elektrophoresegerät.
7. Dekantieren Sie 1x TAE in die Elektrophoresekammer, bis das Gel bedeckt ist.
8. Den Kamm entfernen.
9. Geben Sie 6x Ladefarbstoff (0,25 % Bromphenolblau, 0,25 % Xylolcyanol, 30 % Glycerin) zu den Proben und laden Sie das Gel. Verwenden Sie eine DNA-Leiter, um die Größe des PCR-Produkts zu bestimmen.
10. Bringen Sie die Elektrode an, schalten Sie die Stromversorgung ein und lassen Sie das Gel ~1,5-2 h lang bei 80 V laufen.
11. Schalten Sie das Gerät aus und entfernen Sie das Gel.
12. Färben Sie das Gel mit DNA-Farbstoff (z. B. 10 μl 10 mg/ml Ethidiumbromid) in 100 mL DI-Wasser für 10 min.
13. Entfärben Sie das Gel 20 Minuten lang in DI-Wasser.
14. Visualisieren Sie das Gel auf einem ultravioletten (UV) Lichtsystem und dokumentieren Sie die Ergebnisse.

Ergebnisse

Die PCR von Trophozoiten, die mit pGRUB transfiziert wurden, zeigt, dass das transfizierte CERE durch mindestens sieben Passagen der Trophozoiten sowie durch Enzystung und Exzystment nachgewiesen wird (Abbildung 4). Die in der PCR verwendeten Primer glühen sowohl an den pGEM-Vektor als auch an die CERE-Sequenz, wodurch sichergestellt wird, dass die PCR kein natives CERE nachweist. Die PCR nach Transfektion von pGEM in Trophozoiten zeigte, dass pGEM negativ war (Abbildun...

Diskussion

Das hierin skizzierte Protokoll ist sehr einfach, obwohl jedes Konstrukt wahrscheinlich einen gewissen Grad an Optimierung erfordert, insbesondere des DNA-Transfektionsreagenz-Verhältnisses, abhängig von der Art des Konstrukts und der verwendeten Naegleria-Spezies . Wir haben nur ein kommerziell erhältliches Transfektionsreagenz mit diesem Protokoll getestet, aber es ist wahrscheinlich, dass mehrere andere wirksam sein können. Da ein vollständiger Klon des CERE verwendet wird, der einen funktionellen Urspru...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Bio Rad	161-3102
Ammonium Acetate	Sigma Aldrich	A-7330
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C-4901
Crushed ice
Culture Flasks, T-75	Thermo Scientific	130190
Culture Plate, 6-well	Corning	3506
DNAse	Sigma Aldrich	D-4527
EDTA, 0.5 M	Affymetrix	15694
Electropheresis Gel Apparatus	Amersham Biosciences	80-6052-45
Eppendorf Tubes, 1.5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
Eppendorf Tubes, 2 mL	Fisher Scientific	05-408-138
Ethanol, 100%	Decon Laboratories	2716
Ethidium Bromide	Sigma Aldrich	E-8751
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140
Folic Acid	Sigma Aldrich	F7876-25G
GeneRuler 1 kb Plus Ladder	Thermo Scientific	SM1331
Glacial Acetic Acid	Fisher Scientific	UN2789
GoTaq Green PCR Master Mix	Promega	M7122
Heating Block	Thermo Scientific	88871001
Hemacytometer	Hausser Scientific	1483
Hemin	Sigma Aldrich	51280
Iron Chloride	Sigma Aldrich	372870-256
Ligase	NEB	M2200S
Magneisum Chloride	Fisher Scientific	M33-500
Microfuge	Thermo Scientific	MySpin 12
Microscope	Nikon	TMS
N. gruberi	ATCC	30224
Nucleic Acid	Chem Impex Int’l	#01625
Peptone	Gibco	211677
pGEM	Promega	P2251
Potassium Phosphate	Sigma Aldrich	P0662-500G
PowerPac HC Electropharesis Power Supply Unit	Bio Rad	1645052
Sodium Chloride	MCB Reagents	SX0420
Sodium Phosphate, dibasic	Sigma Aldrich	S2554
Tabletop Centrifuge	eppendorf	5415R
Tris, base	Sigma Aldrich	T1503-1KG
Trypan Blue, 0.4%	Gibco	15250-061
ViaFect Reagent	Promega	E4981
Weigh Scale	Denver Instruments	APX-60
Yeast Extract	Gibco	212750