Verwendung menschlicher Darmorganoide zum Verständnis des Dünndarmepithels auf der Ebene der Transkription einzelner Zellen

Zusammenfassung

Das Protokoll kombiniert die Technologie der menschlichen Darmorganoide mit der Transkriptomanalyse einzelner Zellen, um einen wichtigen Einblick in die bisher unerforschte Darmbiologie zu erhalten.

Zusammenfassung

Die Einzelzell-Transkriptomik hat unser Verständnis der Zellbiologie des menschlichen Körpers revolutioniert. Modernste humane Dünndarm-Organoidkulturen liefern ex vivo Modellsysteme, die die Lücke zwischen Tiermodellen und klinischen Studien schließen. Die Anwendung der Einzelzell-Transkriptomik auf humane Darmorganoide (HIO)-Modelle enthüllt bisher unerkannte Zellbiologie, Biochemie und Physiologie des Magen-Darm-Trakts. Die fortschrittlichen Einzelzell-Transkriptomik-Plattformen verwenden mikrofluidische Partitionierung und Barcoded, um cDNA-Bibliotheken zu generieren. Diese barcodierten cDNAs können von Next-Generation-Sequencing-Plattformen einfach sequenziert und von verschiedenen Visualisierungstools zur Erstellung von Karten verwendet werden. Hier beschreiben wir Methoden zur Kultivierung und Unterscheidung von humanen Dünndarm-HIOs in verschiedenen Formaten und Verfahren zur Isolierung lebensfähiger Zellen aus diesen Formaten, die für den Einsatz in Einzelzell-Transkriptionsprofilierungsplattformen geeignet sind. Diese Protokolle und Verfahren erleichtern die Verwendung von Dünndarm-HIOs, um ein besseres Verständnis der zellulären Reaktion des menschlichen Darmepithels auf transkriptioneller Ebene im Kontext einer Vielzahl unterschiedlicher Umgebungen zu erhalten.

Einleitung

Das Dünndarmepithel besteht aus zwei unterschiedlichen Zonen: der Krypta, in der sich die Darmstammzelle (ISC) befindet, und den Zotten, die aus differenzierten Zellen der sekretorischen und absorptiven Linie bestehen. Zu dieser Komplexität kommt die regionale Spezifität des Epithels hinzu, die einzigartige funktionelle Eigenschaften zwischen den Regionen des Dünndarms bietet. In Pionierarbeit wurden Kulturbedingungen geschaffen, in denen sowohl die menschliche Dünndarmkrypta als auch die Zottenzonen ex vivo aus chirurgischem Gewebe oder Gewebebiopsien erzeugt werden können¹. Diese Kulturen schließen die Lücke zwischen Tierversuchen un....

Protokoll

Die hier verwendeten Organoidlinien wurden aus dem Texas Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core gewonnen. Um zunächst Organoidlinien zu etablieren, wurden Spendergewebeproben gewaschen und enzymatisch verdaut, um die Darmkrypten freizusetzen. Krypten wurden in eine Basalmembran eingebettet und in einem Medium kultiviert. Das Institutional Review Board am Baylor College of Medicine genehmigte das Studienprotokoll zur Gewinnung von Gewebeproben, aus denen Organoidlinien etabliert wurden, und es wurde die Einverständniserklärung aller Spender eingeholt, Organoidlinien aus dem gespendeten Gewebe zu etablieren.

1. Passage von 3D....

Diskussion

Mit Hilfe von Einzelzellgenomik-Plattformen können komplexe biologische Systeme, wie z. B. aus Gewebe gewonnene HIO-Kulturen, die das Darmepithel modellieren, so aufgebrochen werden, dass individuelle zelluläre Beiträge zur biologischen Gesamtreaktion erzielt werden ^4,5,6. Auch zelluläre Heterogenität und seltene Zellpopulationen können identifiziert und abgefragt werden. Der zelluläre Input muss optimiert werden, um den .......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
[Leu15]-Gastrin I	Sigma-Aldrich	G9145	10 nM
0.05% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300054
0.4% Trypan blue	Millipore-Sigma	T8154
0.5 M EDTA	Corning	46-034-CI
1x PBS Ca- Mg-	Corning	21-040-CM
24 mm Transwell	Costar	3412
24 well Nunclon delta surface tissue culture dish	Thermo Scientific	142475
40 µm cell strainer	Falcon	352340
40 µm Flowmi tip strainer	SP Bel-Art Labware	H13680-0040
70 µm Flowmi tip strainer	SP Bel-Art Labware	H13680-0070
96 well plate	Corning	3595
A-83-01	Tocris	2939	500 nM
Accutase	StemCell Technologies	7920
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-028
B27 supplement	Invitrogen	17504-044	1X
Chromium Next GEM Single Cell 3’ GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1	10x Genomics	PN-1000128
Collagen IV	Sigma-Aldrich	C5533-5MG	33 µg/mL
Corning Cell Recovery Solution	VWR	354253
DPBS (Mg2-, Ca2-)	Invitrogen	14190-136	1X
GlutaMAX-I	Invitrogen	35050-061	2 mM
HEPES 1M	Invitrogen	15630-080	10 mM
L-WRN conditioned media	ATCC	CRL-3276
Matrigel, GFR, phenol free	Corning	356231
mouse recombinant EGF	Invitrogen	PMG8043	50 ng/mL
N2 supplement	Invitrogen	17502-048	1X
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G	500 µM
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	10 mM
SB202190	Sigma-Aldrich	S7067	10 µM
Transwell	Corning	3413
Y27632	Stem Cell Technologies	72308	10 µM