Dissoziation von humanen und Maus-Tumorgewebeproben für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur schnellen Dissoziation von menschlichen und Maustumorproben für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung.

Zusammenfassung

Menschliche Tumorproben enthalten eine Fülle von Informationen über ihre Mikroumgebung und ihr Immunrepertoire. Die effektive Dissoziation von humanen Gewebeproben in lebensfähige Zellsuspensionen ist ein erforderlicher Input für die Einzelzell-RNA-Sequenzierungspipeline (scRNAseq). Im Gegensatz zu Bulk-RNA-Sequenzierungsansätzen ermöglicht uns scRNAseq, die transkriptionelle Heterogenität in Tumorproben auf Einzelzellebene abzuleiten. Die Einbeziehung dieses Ansatzes in den letzten Jahren hat zu vielen Entdeckungen geführt, wie z. B. der Identifizierung von Immun- und Tumorzellzuständen und -programmen, die mit dem klinischen Ansprechen auf Immuntherapien und andere Arten von Behandlungen verbunden sind. Darüber hinaus können Einzelzelltechnologien, die auf dissoziierte Gewebe angewendet werden, verwendet werden, um zugängliche Chromatinregionen, das T- und B-Zell-Rezeptorrepertoire und die Expression von Proteinen unter Verwendung von DNA-Barcoded-Antikörpern (CITEseq) zu identifizieren.

Die Lebensfähigkeit und Qualität der dissoziierten Probe sind kritische Variablen bei der Verwendung dieser Technologien, da diese die Kreuzkontamination einzelner Zellen mit Umgebungs-RNA, die Qualität der Daten und die Interpretation dramatisch beeinflussen können. Darüber hinaus können lange Dissoziationsprotokolle zur Eliminierung empfindlicher Zellpopulationen und zur Hochregulierung einer Stressreaktions-Gensignatur führen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir ein schnelles universelles Dissoziationsprotokoll entwickelt, das an mehreren Arten von menschlichen und murinen Tumoren validiert wurde. Der Prozess beginnt mit der mechanischen und enzymatischen Dissoziation, gefolgt von der Filtration, der roten Blutlyse und der Anreicherung von lebenden Toten, die für Proben mit geringem Zelleinsatz (z. B. Nadelkernbiopsien) geeignet ist. Dieses Protokoll gewährleistet eine saubere und lebensfähige Einzelzellsuspension, die für die erfolgreiche Erzeugung von Gel-Bead-In-Emulsionen (GEMs), Barcoding und Sequenzierung von größter Bedeutung ist.

Einleitung

Obwohl viele Fortschritte in der Krebsforschung zur Entwicklung und Zulassung von Wirkstoffen geführt haben, die auf inhibitorische Rezeptoren abzielen, die auf Immun- und Tumorzellen exprimiert werden, sogenannte Checkpoint-Blockade-Inhibitoren, bleiben die Therapieresistenz und die Identifizierung von Mechanismen, die das Ansprechen der Patienten beeinflussen, eine Herausforderung¹. Die komplexe Herausforderung, die Heterogenität von Tumoren anhand ihrer molekularen Diversität und des komplizierten Zusammenspiels zwischen Tumorzellen und der Immunmikroumgebung zu charakterisieren, erfordert neue Ansätze, um dieses komplexe Ökosystem mit Einze....

Protokoll

Diese Studie entsprach allen institutionellen Richtlinien bezüglich der Entnahme von humanem Gewebe. Die Einverständniserklärung der Patienten wurde eingeholt und identifizierbare Probendaten wurden anonymisiert. Die Proben werden im Operationssaal entnommen, in eine Lösung aus RPMI, Kochsalzlösung oder PBS gegeben und über die Pathologie als krebserregend bestätigt, bevor sie in der Forschung verwendet werden. Alle Schritte sollten, sofern nicht anders angegeben, bei 4 °C oder auf Eis durchgeführt werden. Arbeiten Sie bei der Verarbeitung von menschlichem Gewebe in einer Biosicherheitshaube. In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Mat....

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt die Dissoziation von menschlichen oder murinen Tumorproben in eine Einzelzellsuspension für die scRNA-Sequenzierung unter Verwendung des mikrofluidischen Systems 10x Genomics. Bei der Aufbereitung von Geweben, die häufig aus seltenen Krebsarten stammen oder Teil laufender klinischer Studien oder langer Experimente für murine Tumore sind, muss die Probe zwischen allen Schritten optimal und sorgfältig konserviert werden. Alle Schritte sollten schnell auf Eis oder bei 4 °C durchgeführt werd.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Corning	21-040-CV
10 mL serological pipette	Corning	357551
1000 μL low-retention pipette tips	Rainin	30389213
1000 μL low-retention wide pipette tips	Rainin	30389218
1000 μL pipette tips	Rainin	30389212
10x Magnetic Separator	10x Genomics	120250
15 mL conical tubes	Corning	430052
2 mL aspirating pipette	Corning	357558
20 μL low-retention pipette tips	Rainin	30389226
20 μL pipette tips	Rainin	30389225
200 μL low-retention pipette tips	Rainin	30389240
200 μL pipette tips	Rainin	30389239
50 mL Polypropylene Conical Tube	Falcon	352098
60 x 15 mm Tissue Culture Dish	Falcon	353004
ACK Lysing Buffer	Gibco	A10492-1
BD 1 mL syringe	Becton, Dickinson and Company	3090659
Bright-Line Hemocytometer	Hausser Scientific	551660
Calcium Chloride Solution	Sigma Aldrich	2115-100ML
Cell Ranger	10x Genomics	N/A	https://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger/latest
Cell counting slides for TC20 cell counter	Bio-Rad	1450015
CellTrics 30μm sterile disposable filters	Sysmex	04-004-2326
CellTrics 50μm sterile disposable filters	Sysmex	04-004-2327
Dead Cell removal Kit	Miltenyi Biotec	130-090-101	Store at -20 °C; kit 2
Dissecting Forceps, Fine Tip	VWR	82027-386
DNA LoBind Microcentrifuge tubes, 1.5 mL	Eppendorf	22431021
EasySepTM Dead Cell Removal (Annexin V) Kit	STEMCELL Technologies	17899	Store at 4 °C; Kit 1
Eppendorf centrifuge 5425R	Eppendorf	5406000640
Eppendorf centrifuge 5910R	Eppendorf	2231000657
Eppendorf Easypet 3 Electronic Pipette controller	Eppendorf	EP4430000018
Eppendorf Thermomixer F1.5 Model 5384	Eppendorf	EP5384000012
FBS	Gibco	26140-079	Store at 4 °C, use in a Biological hood
German Stainless Scissors	Fine Science Tools	14568-12
Leica Dmi1 Microscope	Leica Microsystems	454793
LS Column	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS Multistand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+	Rainin	17014382
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+	Rainin	17014391
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+	Rainin	17014392
Quadro MACS Magnet	Miltenyi Biotec	130-091-051
RPMI Medium 1640 (1x)	Gibco	21870-076	Store at 4 °C
TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube strips	USA Scientific	1402-4700
Trypan blue stain 0.4%	Thermo Fisher Scientific	T10282
Tumor Dissociation Kit, Human	Miltenyi Biotec	130-095-929	Store at -20 °C, prepare enzymes according to kit instructions: Reconstitute lyophilized Enzyme H vial in 3 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme R vial in 2.7 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme A vial in 1 mL of Buffer A supplied with the kit.
Tumor Dissociation Kit, Mouse	Miltenyi Biotec	130-096-730	Store at -20 °C, prepare enzymes according to kit instructions: Reconstitute lyophilized Enzyme D vial in 3 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme R vial in 2.7 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme A vial in 1 mL of Buffer A supplied with the kit.
UltraPure Distilled Water	Invitrogen	10977-015	Store at 4 °C