Eingebettetes Bioprinting von gewebeähnlichen Strukturen mit κ-Carrageen-Submikrogel-Medium

Zusammenfassung

In dieser Studie wird ein neuartiges κ-Carrageen-Submikrogel-Suspensionsbad vorgestellt, das bemerkenswerte reversible Jamming-Unjamming-Übergangseigenschaften aufweist. Diese Attribute tragen zur Konstruktion biomimetischer Gewebe und Organe im eingebetteten 3D-Bioprinting bei. Das erfolgreiche Drucken von herz-/ösophagusähnlichem Gewebe mit hoher Auflösung und Zellwachstum demonstriert hochwertige Bioprinting- und Tissue-Engineering-Anwendungen.

Zusammenfassung

Der eingebettete dreidimensionale (3D) Biodruck unter Verwendung eines körnigen Hydrogel-Stützbades hat sich als wichtige Technik für die Erstellung biomimetischer Gerüste erwiesen. Die Entwicklung eines geeigneten Gelsuspensionsmediums, das die präzise Abscheidung von Biotinte mit der Lebensfähigkeit und Funktion der Zellen in Einklang bringt, stellt jedoch mehrere Herausforderungen dar, insbesondere bei der Erzielung der gewünschten viskoelastischen Eigenschaften. Hier wird ein neuartiges κ-Carrageen-Gel-Stützbad durch einen einfach zu bedienenden mechanischen Mahlprozess hergestellt, wodurch homogene submikroskalige Partikel hergestellt werden. Diese Submikrogele weisen ein typisches Bingham-Fließverhalten mit geringer Fließspannung und schnellen Scherverdünnungseigenschaften auf, die eine reibungslose Abscheidung von Biotinten ermöglichen. Darüber hinaus gewährleisten der reversible Gel-Sol-Übergang und die Selbstheilungskräfte des κ-Carrageen-Mikrogel-Netzwerks die strukturelle Integrität der gedruckten Konstrukte und ermöglichen die Schaffung komplexer, mehrschichtiger Gewebestrukturen mit definierten architektonischen Merkmalen. Nach dem Druck können die κ-Carrageen-Submikrogele leicht durch eine einfache phosphatgepufferte Kochsalzlösung entfernt werden. Weiteres Bioprinting mit zellbeladenen Biotinten zeigt, dass Zellen innerhalb der biomimetischen Konstrukte eine hohe Lebensfähigkeit von 92% aufweisen und Pseudopodien schnell vermehren sowie eine robuste Proliferation beibehalten, was auf das Potenzial dieser Bioprinting-Strategie für die Gewebe- und Organherstellung hinweist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses neuartige κ-Carrageen-Submikrogel-Medium einen vielversprechenden Weg für eingebettetes Bioprinting von außergewöhnlicher Qualität darstellt und tiefgreifende Auswirkungen auf die In-vitro-Entwicklung von gentechnisch hergestellten Geweben und Organen hat.

Einleitung

Tissue-Engineering-Gerüste, einschließlich elektrogesponnener Fasern, poröser Schwämme und Polymer-Hydrogele, spielen eine zentrale Rolle bei der Reparatur und Rekonstruktion geschädigter Gewebe und Organe, indem sie ein strukturelles Gerüst bieten, das das Zellwachstum, die Geweberegeneration und die Wiederherstellung der Organfunktion unterstützt ^1,2,3. Herkömmliche Gerüste stoßen jedoch auf Herausforderungen bei der genauen Nachbildung nativer Gewebestrukturen, was zu einer Diskrepanz zwischen dem technischen und dem natürlichen Gewebe führt. Diese Einschränkung behindert die effiziente Heilung von defektem Gewebe und unterstreicht die dringende Notwendigkeit von Fortschritten beim Gerüstdesign, um eine genauere Biomimikry zu erreichen. Dreidimensionales (3D) Bioprinting ist eine innovative Herstellungstechnik, die komplexe biologische Gewebestrukturen Schicht für Schicht mit Hilfe von Biomaterialtinten und -zellen präzise konstruiert⁴. Unter den verschiedenen Biomaterialien erweisen sich Polymer-Hydrogele mit ihrem unverwechselbaren Netzwerk, das die In-situ-Verkapselung von Zellen erleichtert und ihr Wachstum entscheidend unterstützt, als ideale Biotinten ^5,6. Nichtsdestotrotz neigen viele weiche und hochhydratisierte Hydrogele dazu, während des Druckprozesses eine Unschärfe oder einen schnellen Zusammenbruch der gedruckten Gerüststrukturen zu induzieren, wenn sie als Biotinten verwendet werden. Um diese Herausforderung zu meistern, verwendet die eingebettete 3D-Bioprinting-Technologie ein Mikrogelbad als Stützmaterial, das eine präzise Abscheidung von weicher Biotinte ermöglicht. Nach der Gelierung der Hydrogel-Biotinten werden durch Entfernen des Mikrogelbads veredelte bionische Gerüste mit komplizierten Strukturen erhalten. Materialien wie Gelatine ^7,8, Agarose⁹ und Gellangummi^10,11 wurden verwendet, um Mikrogelbäder für den eingebetteten 3D-Biodruck herzustellen und die Anwendung von weichen Hydrogelen im Tissue Engineering erheblich voranzutreiben. Die mikrometergenaue und ungleichmäßige Partikelgröße dieser Partikelgele wirkt sich jedoch nachteilig auf die Auflösung und Wiedergabetreue des 3D-Drucks^aus 12,13,14. Es besteht ein dringender Bedarf, einen gelartigen Suspensionsschwimmer mit kleinen und gleichmäßig dispergierten Partikeln herzustellen, der Vorteile bei der Erzielung von High-Fidelity-Bioprinting bietet.

In diesem Protokoll wird ein neuartiges Opfergranulat-κ-Carrageen-Suspensionsbad mit einem einheitlichen Submikron-Gehalt für den eingebetteten 3D-Druck vorgestellt. Dieses innovative Submikrogel-Badverhalten des schnellen Jamming-Unjamming-Übergangs ermöglicht die präzise Herstellung von biomimetischen Hydrogel-Gerüsten mit hoher Strukturtreue¹⁵. Unter Verwendung dieses neuen Suspensionsmediums wird eine Reihe von biomimetischen Gewebe- und Organkonstrukten mit mehrschichtigen Gewebestrukturen erfolgreich gedruckt, wobei eine Komposit-Biotinte aus Gelatinemethacrylat und Seidenfibromethacrylat verwendet wird. In dieser Studie haben wir die Speiseröhre als biomimetisches 3D-Bioprinting-Objekt ausgewählt, vor allem weil die Speiseröhre nicht nur eine mehrschichtige Gewebestruktur aufweist, sondern auch ihre Muskelschicht eine innere kreisförmige und eine äußere longitudinale komplexe Schichtstruktur aufweist. Die Sicherstellung der richtigen Ausrichtung und Organisation dieser Schichten ist für die Regeneration des funktionellen Gewebes unerlässlich. Daher ist es uns ein großes Anliegen, die vielschichtige Architektur der Speiseröhre nachzubilden. Noch wichtiger ist, dass wir κ-Carrageen-Submikrogele als Suspensionsbad und GelMA/SFMA als Biotinte verwendeten, um ein biomimetisches Gerüst für das Tissue Engineering zu entwerfen und zu konstruieren. Die gedruckte Speiseröhre kann durch wiederholtes Waschen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung leicht gelöst werden. Darüber hinaus ist das κ-Carrageen-Submikrogelbad frei von zytotoxischen Substanzen, was eine hohe Zytokompatibilität gewährleistet¹⁵. Die glatten Muskelzellen, die in anisotropen Gerüsten geladen sind, zeigen eine bemerkenswerte Spreizaktivität. Dieses einheitliche Sub-Mikrogel-Suspensionsmedium bietet einen neuen Weg für die Herstellung komplexer Gewebe und Organe durch eingebetteten 3D-Biodruck.

Protokoll

1. Vorbereitung des κ-Carrageen-Submikrogel-Suspensionsbades

1. Bereiten Sie 500 mL κ-Carrageen-Suspensionsbad (0,35 % Gew./Vol.) vor, indem Sie 1,75 g κ-Carrageenpulver in 500 mL phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) in einer 1.000 mL Glasflasche geben.
2. Führen Sie einen 70 mm Magnetrührstab in die Glasflasche ein, um die wässrige Mischung zu verrühren. Ziehen Sie den Glasflaschenverschluss fest und lösen Sie ihn dann um eine halbe Umdrehung.
3. Stellen Sie die Glasflasche in ein 70 °C heißes Wasserbad und erhitzen Sie sie. Schalten Sie den Magnetrührer mit einer Drehzahl von 300 U/min ein, stellen Sie die Flasche auf und rühren Sie, bis sich das Polymer vollständig aufgelöst hat.
4. Nehmen Sie eine weitere Glasflasche und stellen Sie sie zur Sterilisation in einen Autoklaven mit 121 °C für 30 Minuten.
5. Nachdem der Hochdrucksterilisator auf 80 °C abgekühlt ist, nehmen Sie die Flasche aus dem Sterilisator und stellen Sie sie zur weiteren Handhabung auf die ultrareine Werkbank.
6. Die vollständig gelöste κ-Carrageen-Lösung wird mit einem 0,22 μm Filter in die sterilisierte Glasflasche filtriert.
   HINWEIS: Führen Sie die Filtration schnell durch, während die Lösung heiß ist, um zu verhindern, dass das κ-Carrageen abkühlt und den Filter verstopft.
7. Die κ-Carrageen-Lösung wird 12 h lang bei 4 °C gelagert, um eine kationenvernetzte Gelierung zu induzieren.
8. Mahlen Sie die κ-Carrageen-Hydrogele mechanisch mit einem 60-mm-Magnetrührer mit einer Rührgeschwindigkeit von 1200 U/min bei 25 °C, bis es erfolgreich in einen flüssigen Zustand übergeht, was ca. 60 Minuten dauert.
   HINWEIS: Lagern Sie die κ-Carrageen-Hydrogele zwischen 25-37 °C, um eine Gelierung bei niedrigen Temperaturen oder eine Auflösung bei hohen Temperaturen zu vermeiden.

2. Herstellung von Biotinten aus Gelatinemethacrylat/Seidenfibroinmethacrylat-Verbundwerkstoffen

1. Bereiten Sie Komposit-Biotinten her, indem Sie 10 % (wt/vol) Gelatinemethacrylat (GelMA) und 6 % (wt/vol) Seidenfibroinmethacrylat (SFMA) in PBS-Lösung (pH 7,4) kombinieren. Wiegen Sie 2,0 g GelMA und 1,2 g SFMA-Pulver separat ab.
2. Geben Sie die Pulver langsam in zwei 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie 10 mL PBS-Lösung separat in die 50 mL Zentrifugenröhrchen.
3. Jeweils mit einem 10 mm Magnetrührer bestücken und ständig umrühren und im Wasserbad bei 45 °C erhitzen. Lassen Sie die GelMA- und SFMA-Pulver vollständig auflösen, was ca. 30 Minuten dauert.
4. Die GelMA- und SFMA-Lösungen werden in gleichem Volumen unter ständigem Rühren bei 45 °C gemischt. Filtern Sie die Komposit-Biotinten mit einem Filter mit einer Porengröße von 100 μm.
5. Sterilisieren Sie die Komposit-GelMA/SFMA-Biotinten durch UV-Bestrahlung in einer Biosicherheitswerkbank für 12 h.
   HINWEIS: Bereiten Sie die Biotinten sofort vor und verwenden Sie sie, um eine vorzeitige Gelierung der SFMA durch Selbstorganisation zu verhindern.

3. Rheologische Charakterisierung des κ-Carrageen-Submikrogel-Suspensionsbades

1. Inbetriebnahme und Vorbereitung von rheologiebezogenen Geräten.
   1. Schalten Sie den Luftkompressor für 30 Minuten ein und stellen Sie sicher, dass der Druck 30 psi erreicht. Entfernen Sie die Lagerklemme, indem Sie die Zugstange gegen den Uhrzeigersinn drehen. Befestigen Sie die schwarze Abdeckung darunter und drehen Sie die Knopfachse oben am Instrument im Uhrzeigersinn.
   2. Schalten Sie das Rheometer ein und lassen Sie es initialisieren. Schalten Sie den Wasserumlaufschalter ein und lassen Sie die Temperatur 15 °C erreichen.
   3. Öffnen Sie die Rheometer-Steuerungssoftware, um die Online-Verbindung herzustellen.
2. Kalibrieren Sie das Rheometer und installieren Sie die parallele Plattengeometrie.
   1. Führen Sie die Gerätekalibrierung in der Steuerungssoftware durch, was hauptsächlich die Anpassung des Trägheitspfads des Kalibrierinstruments umfasst. Montieren Sie eine parallele Plattengeometrie mit einem Durchmesser von 40 mm am Ende der Zugstange. Halten Sie die Sperrtaste 3 Sekunden lang gedrückt, um die Motorwelle in die Ausgangsposition zu bewegen und eine konsistente Geometrieplatzierung zu gewährleisten.
   2. Wählen Sie in der Steuerungssoftware den Kalibrier-Manager aus und klicken Sie anschließend auf die Tasten Trägheit, Reibungskalibrierung und Rotationsabbildung , um die parallele Plattengeometrie zu kalibrieren.
3. Nullen Sie die Spalthöhe des Rheometers, indem Sie ein Standardverfahren zur Spaltnullierung durchführen, um eine präzise Messung zu gewährleisten.
4. Richten Sie die Versuchsschritte ein, einschließlich einer Strömungsrampe mit einer Scherrate von 0,01 bis 1000 1/s, einem Amplituden-Sweep von 0,1 % bis 100 % Dehnung bei 10 rad/s, einem mehrstufigen Oszillationszeit-Sweep mit einer Dauer von 60 s und abwechselnden Dehnungen von 1 % und 100 % bei 10 rad/s und einem mehrstufigen Peak-Hold-Sweep mit einer Dauer von 120 s und einer abwechselnden Scherrate von 0,1 1/s und 10 1/s.
5. Geben Sie 2 ml 0,35 % κ-Carrageen-Suspensionen auf die Peltier-Platte des Rheometers.
6. Positionieren Sie den Geometriespalt auf 510 μm und entfernen Sie einen überschüssigen Überlauf am Rand der Spannvorrichtung. Stellen Sie den Probenspalt auf 500 μm ein, damit sich die Probe leicht über den Klemmrand hinaus erstrecken kann.
7. Führen Sie ein Strömungsexperiment durch, indem Sie die Strömungsrampe aus den Optionen für den Versuchsplan auswählen.
   1. Wählen Sie den Test Strömungsrampe im Versuchsplan aus. Stellen Sie die Schergeschwindigkeiten von 0,001 bis 10 1/s bei einer Temperatur von 25 °C ein.
   2. Führen Sie Schritt 3.5 und das Experiment Strömungsrampe für die hinzugefügte Probe aus.
8. Führen Sie einen zyklischen Peak-Hold-Test durch, um die Rückgewinnungsleistung des Materials zu bewerten.
   1. Wählen Sie im Versuchsplan den Peak Hold Sweep und stellen Sie 5 aufeinanderfolgende Experimente mit einer Zeit von 120 s bei 25 °C ein.
   2. Legen Sie die Scherrate für den ersten, dritten und fünften Schritt auf 0,01 1/s und für den zweiten und vierten Schritt auf 10 1/s fest.
   3. Fügen Sie eine neue Probe von 2 ml hinzu. Führen Sie Schritt 3.5 und den zyklischen Wiederherstellungstest durch.
9. Durchführung einer Viskoelastizitätsanalyse, um den potenziellen Gel-Sol-Übergang des κ-Carrageen-Suspensionsbades zu bewerten.
   1. Wählen Sie den Amplituden-Sweep-Test in der Versuchsplanung aus. Die Schwingungsdehnung wird bei einer Temperatur von 25 °C von 0,1 % bis 100 % eingestellt. Klicken Sie auf "Start ", um das Amplituden-Sweep-Experiment für das hinzugefügte Sample durchzuführen.
10. Führen Sie eine alternative Dehnungsanalyse durch, um die elastische Rückstellleistung des Materials zu bewerten.
    1. Wählen Sie Oszillation Time Sweep im Versuchsdesign und setzen Sie 5 aufeinanderfolgende Experimente mit einer Zeit von 60 s bei 25 °C.
    2. Stellen Sie die Dehnung für den ersten, dritten und fünften Schritt auf 1 % und für den zweiten und vierten Schritt auf 100 % ein.
    3. Fügen Sie eine neue Probe von 2 ml hinzu. Führen Sie Schritt 3.5 und den kontinuierlichen zyklischen Wiederherstellungstest durch.
       HINWEIS: Reinigen Sie die Geometrieplatte und die Peltierplatte nach jedem Versuchstest und fügen Sie eine neue Probe von 2 ml hinzu.

4. Drucken von biomimetischen Hydrogel-Gerüsten mit einem speziell entwickelten Mikroextrusions-Biodrucker

1. Entwerfen Sie Würfel im STL-Format mit einer 3D-Grafiksoftware und laden Sie gewebeähnliche Modelle aus der 3D-Datenbank herunter (www.thingiverse.com; https://3d. nih.gov/.).
   1. Importieren Sie die Modelle im STL-Format in die PANGO Software und geben Sie die Druckparameter ein. Legen Sie die spezifischen X-, Y- und Z-Koordinaten des Modells im 3D-Raum fest, geben Sie die erwartete Skalierungsgröße des Modells in Millimetern (mm) ein, passen Sie die Größe und das Skalierungsverhältnis des Objekts auf der X-, Y- und Z-Achse an und passen Sie den Drehwinkel des Modells im Raum nach Bedarf an.
   2. Geben Sie den geschätzten Filamentdurchmesser (in der Regel etwa 200-500 μm für die meisten Biotinten) in das Feld für die Schichtdicke ein, um die Dicke jeder Schicht auf der Z-Achse zu bestimmen. Stellen Sie die Druckgeschwindigkeit entsprechend der erwarteten Linienstärke (ca. 10-90 mm/s) und stellen Sie die Fülldichte auf 30%-80% ein.
   3. Exportieren Sie die finalen Parameter als G-Code auf eine SD-Karte.
2. Lassen Sie den Biodrucker und die Mikroextrusionspumpe laufen.
   1. Schalten Sie die Steuerung der Mikroextrusionspumpe ein, wählen Sie die entsprechende Volumenspritze (5 mL) aus und stellen Sie die Extrusionsrate auf 0,08 mL/min und die Extrusionsdauer in Abstimmung mit der gewünschten Druckzeit ein, die durch Division des Hydrogelvolumens durch die Extrusionsrate erzielt wird.
   2. Setzen Sie die Spritze mit einer Nadel mit einem Innendurchmesser von 210 μm in den Spritzenschlitz des Biodruckers ein.
   3. Stellen Sie die Spritzensteuerung so ein, dass der Kolben der Spritze in engem Kontakt mit der Schraube steht.
   4. Geben Sie 3 ml Suspensionsbad in eine 35-mm-Zellkulturschale. Positionieren Sie die Schale basierend auf den Codeeinstellungen auf der Plattform und vergewissern Sie sich, dass sich der Druckkopf 1 mm über dem Boden der Schale befindet.
      HINWEIS: Führen Sie einen Vortest durch, um die Genauigkeit der Schüsselpositionen auf der Druckplattform während des Drucks sicherzustellen.
   5. Legen Sie die SD-Karte mit dem Code in den 3D-Biodrucker ein, aktivieren Sie die Codedatei, starten Sie den Biodrucker und klicken Sie auf die Schaltfläche Start auf dem Controller.
3. Bearbeitung der Konstrukte
   1. Setzen Sie das gedruckte Konstrukt 1 Minute lang 405 nm blauem Licht aus, um die Photovernetzung zu starten.
   2. Entfernen Sie das κ-Carrageen-Gel mit einer 1-ml-Pipette, gefolgt von der Zugabe von 3 mL PBS (pH 7,4) zum Waschen und anschließenden Entfernen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für eine gründliche Wäsche.
      HINWEIS: Führen Sie den Waschvorgang vorsichtig durch, um eine Beschädigung der gedruckten Konstrukte zu vermeiden.

5. Eingebettetes 3D-Bioprinting von Analoga der Speiseröhrenmuskulatur

1. Kultivieren Sie glatte Muskelzellen (eSMCs) der Speiseröhre von Kaninchen.
   1. Die Kultur wird in T75-Kolben mit 2 x 10⁶ Zellen unter Verwendung von 15 ml DMEM-Medium, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % Penicillin/Streptomycin, eingeleitet.
   2. Halten Sie die eSMCs bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ und 95 % Luft, bis sie eine Konfluenz von 80 % erreichen.
2. Herstellung von Biotinte für die Muskelschicht der Speiseröhre
   1. Aspirieren Sie das Medium bei Erreichen der Konfluenz und waschen Sie die eSMCs mit 5 mL 1x PBS.
   2. 2 ml 0,2 % Trypsin-EDTA in den Kolben geben und 2 Minuten inkubieren, um die Zellen zu verdauen. Tippen Sie auf den Kolben, um die Zellen von der Wand zu lösen.
   3. Beenden Sie den Aufschluss durch Zugabe von 2 mL DMEM und überführen Sie die Zellsuspension in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Messen Sie die Zelldichte mit einem Zellzähler mit 10 μl Zellsuspension.
   4. Bei 675 x g für 3 min zentrifugieren, den Überstand vorsichtig ansaugen und das Zellpellet in den Komposit-GelMA/SFMA-Biotinten resuspendieren (wie in Schritt 2.1 vorbereitet). Passen Sie die endgültige Zellkonzentration an, um eine Dichte von 10 x 10⁶ Zellen/ml in der Biotinte zu erreichen und so die Bedingungen für nachfolgende 3D-Bioprinting-Anwendungen zu optimieren.
3. Vorbereitung des 3D-Biodruckers und der zugehörigen Materialien
   1. Autoklavieren Sie die wichtigsten Druckinstrumente, einschließlich Spritzennadeln, Pinzetten, einem Magnetrührer und einer 1000-ml-Silikatglasflasche, unter Standard-Sterilisationsbedingungen (121 °C für 30 Minuten), um eine aseptische Umgebung für den Druckprozess zu gewährleisten.
   2. Stellen Sie den Bioprinter in eine Biosicherheitswerkbank und sterilisieren Sie ihn 30 Minuten lang mit ultraviolettem (UV) Licht, um die Sterilität zu erhalten.
   3. Bereiten Sie 50 ml steriles κ-Carrageen und 5 ml sterile GelMA/SFMA-Komposit-Biotinten vor, wie in Schritt 1 bzw. Schritt 2 beschrieben.
   4. Entwerfen Sie das Modell, stellen Sie die gewünschten Parameter ein und bereiten Sie den Bioprinter vor, wie in Schritt 4.1 beschrieben.
4. Initiierung des Bioprinting-Prozesses
   1. Führen Sie die in den Schritten 4.2 und 4.3 beschriebenen Verfahren durch, um die 3D-Ösophagusmuskelschicht zu biodrucken, gefolgt von PBS-Waschen und -Austausch.
   2. Führen Sie während des gesamten Druckprozesses einen Zelldruck mit sterilen Techniken durch, um das Risiko einer Zellkontamination in der gedruckten Struktur zu minimieren.
5. Austausch von Zellkulturmedien nach dem Druck
   1. Aspirieren Sie das PBS vorsichtig und ersetzen Sie es durch 3 ml DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % Penicillin/Streptomycin. Stellen Sie sicher, dass die gedruckten Konstrukte vollständig eingetaucht sind, um optimale Zellwachstumsbedingungen zu gewährleisten.
   2. Die Zellkulturschale mit den gedruckten Konstrukten wird in einem auf 37 °C eingestellten Inkubator mit 5 % CO₂ inkubiert. Ersetzen Sie das Zellkulturmedium täglich durch frisches Medium, verwenden Sie jedes Mal 3 ml und überwachen Sie den Zustand der Zellen in den Konstrukten mit Hilfe der Lichtmikroskopie.

6. Bewertung der Lebensfähigkeit von eSMCs in den gedruckten Konstrukten mittels Live/Dead-Assay-Färbung

1. Entfernen Sie das Zellkulturmedium nach 5 Stunden Inkubation und waschen Sie die zellbeladenen Konstrukte mit PBS.
2. Geben Sie 2 mL der Standard-Calcein-AM/Propidiumiodid-Lösung (1:1000) zu den gedruckten zellbeladenen Konstrukten und inkubieren Sie.
3. Waschen Sie die Konstrukte nach einer 45-minütigen Inkubation 3x mit PBS und fügen Sie dann frisches Zellkulturmedium hinzu.
4. Beobachten Sie lebende und tote Zellen und nehmen Sie Fluoreszenzbilder mit der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) auf.

7. Beobachtung der eSMCs innerhalb der gedruckten Konstrukte mittels FITC-Phalloidin/DAPI-Färbung

1. Färben Sie die gedruckten Konstrukte mit Fluorescein-Isothiocyanat (FITC), markiertem Phalloidin (Grün) für F-Aktin und 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, blau) für den Kern nach 5 Tagen Inkubation.
2. Vorbereitung der Fixierlösung
   1. Kombinieren Sie 4 mL 1x PBS mit 0,16 mL Paraformaldehyd (PFA) in einem 5 mL Polyethylen (PE)-Röhrchen, um eine Endkonzentration von 4% zu erreichen.
   2. Stellen Sie die Kulturschale mit den biogedruckten Konstrukten auf eine saubere Oberfläche. Entfernen Sie das Medium und bedecken Sie die Konstrukte vorsichtig mit der PFA-Lösung, um sicherzustellen, dass sie vollständig eintauchen. Lassen Sie die Fixierung 20 Minuten lang bei Raumtemperatur erfolgen, bevor Sie die Lösung verwerfen.
      HINWEIS: Gehen Sie während des Zufüge- und Entfernungsprozesses vorsichtig mit Flüssigkeiten um, um die strukturelle Integrität der biogedruckten Konstrukte zu erhalten.
   3. Geben Sie 2,5 ml 1x PBS in die Kulturschale und tauchen Sie die Konstrukte vollständig ein, um alle verbleibenden Färbereagenzien zu entfernen.
3. Permeabilisierung der Zellmembran
   1. Formulieren Sie eine 0,5%ige Triton X-100-Lösung, indem Sie 20 μl Triton X-100 zu 4 mL 1x PBS in einem 5 mL PE-Röhrchen hinzufügen.
   2. Verabreichen Sie die Triton X-100-Lösung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Zellmembranen zu durchdringen, und entfernen Sie dann die Lösung.
   3. Geben Sie 2,5 ml 1x PBS in die Kulturschale und tauchen Sie die Konstrukte vollständig ein, um alle verbleibenden Färbereagenzien zu entfernen.
4. Blockieren unspezifischer Bindungen
   1. Stellen Sie eine 3%ige Blockierungslösung aus Rinderserumalbumin (BSA) in einem 5-ml-PE-Röhrchen her, indem Sie 0,12 mL BSA zu 4 mL 1x PBS hinzufügen.
   2. Führen Sie die BSA-Lösung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in die Konstrukte ein, um unspezifische Stellen zu blockieren, und verwerfen Sie dann die Lösung.
5. Aktinfärbung mit FITC-Phalloidin
   1. 0,2%ige FITC-Phalloidin-Lösung in einem 5 mL PE-Röhrchen mit 4 mL 1x PBS und 8 μl Färbereagenz herstellen.
   2. Tauchen Sie die Konstrukte 60 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln in diese Lösung und entsorgen Sie dann die Lösung.
   3. Geben Sie 2,5 ml 1x PBS in die Kulturschale und tauchen Sie die Konstrukte vollständig ein, um verbleibende Färbereagenzien zu entfernen.
6. Nukleare Färbung mit DAPI
   1. Tragen Sie 4 ml DAPI-Färbelösung auf die Konstrukte auf und stellen Sie eine vollständige Abdeckung sicher.
   2. Inkubieren Sie 20 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur, bevor Sie die DAPI-Lösung entfernen.
7. Abschließendes Waschen und PBS-Eintauchen: Geben Sie 2,5 ml 1x PBS in die Kulturschale und tauchen Sie die Konstrukte vollständig ein, um verbleibende Fleckenreagenzien zu entfernen.
   HINWEIS: Bereiten Sie Färbelösungen im Voraus vor und gehen Sie vorsichtig damit um. Zu keinem Zeitpunkt sollten die Zellen innerhalb des Kulturgefäßes austrocknen.
8. Beobachtung mit einem konfokalen Mikroskop: Untersuchen und abbilden Sie die gefärbten Konstrukte mit der konfokalen Mikroskopie, um das Zellwachstum zu beurteilen und eine umfassende Dokumentation der Ergebnisse zu gewährleisten.

8. Bewertung der Proliferation von eSMCs innerhalb der gedruckten Konstrukte mit Hilfe des CCK-8-Assays

1. Entfernen Sie das Nährmedium an den Tagen 7 und 14 aus den Konstrukten. Waschen Sie die Konstrukte mit PBS, um Medienreste und abgelöste Zellen zu entfernen.
2. Fügen Sie jedem Konstrukt CCK-8-Lösung gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzu. Stellen Sie sicher, dass das Volumen der CCK-8-Lösung ausreicht, um jedes Konstrukt vollständig abzudecken.
3. Inkubieren Sie die Konstrukte mit der CCK-8-Lösung bei 37 °C für 2 h. Nach der Inkubation wird der Überstand vorsichtig auf eine neue 96-Well-Platte umgefüllt.
4. Messen Sie die Extinktion bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader.

Ergebnisse

Das körnige κ-Carrageen-Gelbad wurde durch mechanisches Aufbrechen der Bulk-Hydrogele in eine partikuläre Gelaufschlämmung erzeugt. Die jüngste Studie zeigte, dass die κ-Carrageen-Partikel einen durchschnittlichen Durchmesser von etwa 642 ± 65 nm mit einheitlichen Morphologien bei mechanischer Mischung von 1000 U/min¹⁵ aufwiesen, was deutlich kleiner ist als die Abmessungen von Mikrogelen, die zuvor in der Literatur berichtet wurden 16,17,18

Diskussion

Die Herstellung von κ-Carrageen-Submikrogel-Suspensionsbädern für den Einsatz im Bioprinting ist ein sorgfältig orchestrierter Prozess, der mehrere kritische Schritte umfasst, um sicherzustellen, dass das resultierende Medium die gewünschten Eigenschaften zur Unterstützung von Biotinten aufweist. Zunächst wird eine κ-Carrageen-Lösung hergestellt, indem das κ-Carrageen-Pulver in deionisiertem Wasser bei erhöhten Temperaturen aufgelöst wird, wodurch eine homog...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D bioprinter	Custom-designed
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole	Solarbio Life Science	C0065	Ready-to-use
405 nm UV light	EFL	XY-WJ01
Cell Counter	Corning	Cyto smart 6749
Confocal laser scanning microscope	Leica	STELLARIS 5
DMEM high glucose	VivaCell	C3113-0500	High Glucose, with Sodium Pyruvate and L-Glutamine
Dynamic rotational rheometer	TA Instrument	Discovery HR-20
Esophageal smooth muscle cells	Supplied by the Department of Cell Biology and Regenerative Medicine, Health Science Center, Ningbo University		Primary cells from the rabbit esophagus
Fetal bovine serum	UE	F9070L
Fluorescein isothiocyanate labeled phalloidin	Solarbio Life Science	CA1610	300T
Gelatin methacrylate	EFL	EFL-GM-60	60% substitution
k-carrageenan	Aladdin	C121013-100g	Reagent grade
Lithium Phenyl (2,4,6-trimethylbenzoyl) phosphinate	Aladdin	L157759-1g	365~405 nm
Live-Dead kit	beyotime	C2015M
Microplate reader	Potenov	PT-3502B
Paraformaldehyde	Solarbio Life Science	P1110	4%
Penicillin/streptomycin	Solarbio Life Science	MA0110	100 ´
Phosphate buffered saline	VivaCell	C3580-0500	pH 7.2-7.4
Silk fibroin methacrylate	EFL	EFL-SilMA-001	39% substitution
Triton X-100	Solarbio Life Science	T8200
Trypsin-EDTA	VivaCell	C100C1	0.25%, without phenol red