Weniger invasive Technik für nicht-stabilisierte Unterkieferfraktur in Mausmodellen

Summary

Dieses Protokoll stellt eine umfassende und effiziente Methode zur Analyse der Unterkieferknochenreparatur dar. Wir beschreiben eine reproduzierbare Technik für die nicht-stabilisierte Unterkieferfraktur im Mausmodell, die es ermöglicht, den Prozess der endochondralen Knochenreparatur mit minimaler Gewebeschädigung und Knochenverlust zu analysieren.

Abstract

Bei Mäusen können nicht-stabilisierte Frakturen an Unterkieferstellen vorgenommen werden, so dass die Knochenreparatur mit Hilfe eines endochondralen Ossifikationsmodus analysiert werden kann. Um diesen Prozess in vivo so genau wie möglich abzubilden, ist ein standardisiertes Protokoll erforderlich, um übermäßigen Knochenverlust und Weichteilschäden zu vermeiden, insbesondere an der Unterkieferstelle, einer anatomischen Stelle, die durch minimalen Zugang gekennzeichnet ist. Unseres Wissens beschreiben wir zum ersten Mal ein weniger invasives Protokoll der nicht-stabilisierten Unterkieferfraktur bei Mäusen. Erwachsene Mäuse werden mit Isofluran anästhesiert und erhalten eine präoperative Dosis von Buprenorphin durch subkutane Injektion. Es wird ein submandibulärer Zugang durchgeführt, bei dem ein Hautschnitt entlang des unteren Randes des Unterkiefers vorgenommen wird. Der Kaumuskel ist in einer subperiostalen Ebene entlang des Ramus mandibularis mit einem Periostlift angehoben. Eine vertikale und vollständige Fraktur des Ramus wird von der basilären Grenze bis zur koronoiden Kerbe (zwischen Kondylen- und Coronoidfortsätzen) unter Verwendung eines piezoelektrischen Knochenchirurgiegeräts unter Kochsalzlösung, Serumspülung am Basilarand und einer Schere durchgeführt, um die Fraktur des Unterkieferastes zu vervollständigen. Der Hautzugang wird durch Seidennähte verschlossen. Dieses detaillierte Verfahren für nicht stabilisierte Unterkieferfrakturen bietet ein effizientes Verfahren, das einen minimalen Knochenverlust und eine Schädigung des Weichgewebes ermöglicht. Diese Technik gewährleistet erfolgreiche und konsistente Ergebnisse, um den Prozess der endochondralen Knochenreparatur in Mausmodellen genau widerzuspiegeln.

Introduction

Die Knochenreparatur impliziert sowohl membranöse als auch endochondrale Ossifikationsprozesse, abhängig von der Fraktur oder der Osteotomie-Stabilisierung. Die Knochenreparatur nach stabilisierten Knochenosteotomien oder Frakturen beruht auf einer membranösen Ossifikation, während sich nicht stabilisierte Frakturen oder schlecht stabilisierte Osteotomien nach einem Modus der endochondralen Ossifikation^{verfestigen 1}. Die membranöse Knochenreparatur ist gekennzeichnet durch die Knochenbildung durch direkte Differenzierung von mesenchymalen Zellen in Osteoblasten, während die endochondrale Knochenreparatur die Bildung einer transienten knorpeligen Matrize beinhaltet, die sich in Osteoblasten differenziert, um den Knochenkallus² zu bilden.

Die Knochenreparatur hängt von mehreren Gewebe- und Zellinteraktionen ab. Sie wird auch von ortsspezifischen Faktoren und von der auf den Kallus³ ausgeübten Kraft beeinflusst. Der Unterkieferknochen ist ein beweglicher Knochen, der Kaukräfte unterstützt, die hauptsächlich aus kortikalem Knochen bestehen. Der Prozess der Reparatur des Unterkieferknochens wird von der Stelle und der Richtung der Fraktur beeinflusst. Es ist allgemein bekannt, dass Muskel- und Periostverletzungen die Knochenkonsolidierung sowie einen wichtigen Knochenverlust an der Frakturstelle ^4,5,6 beeinträchtigen können.

Die Analyse der endochondralen Unterkieferknochenreparatur impliziert standardisierte und reproduzierbare Protokolle für wertvolle, unvoreingenommene Vergleiche. In der Literatur berichten nur wenige Autoren über Protokolle für nicht-stabilisierte Unterkieferfrakturen in Mausmodellen ^3,7, und zwar meist mit anteriorer Richtung auf molaren^{Höhe 8}. Durch die Entwicklung dieser Technik wollen wir Muskel- und Periostverletzungen vermeiden und den Knochenverlust an der Frakturstelle begrenzen, um den Prozess der endochondralen Knochenreparatur ohne Störfaktoren bestmöglich zu analysieren. Darüber hinaus bestand der Zweck der Entwicklung einer neuen Technik für Unterkieferfrakturen bei Mäusen darin, postoperative Schmerzen und den Tod von Tieren, die bei solchen Operationen bei Kleintieren häufig auftreten, zu minimieren. Zum ersten Mal beschreiben wir ein weniger invasives Protokoll für nicht-stabilisierte Unterkieferfrakturen auf Ramusebene bei Mäusen. Dieses In-vivo-Protokoll vermeidet übermäßige Muskel- und Periostschäden oder Knochenschwund an der Frakturstelle und trägt dazu bei, das Ausmaß der postoperativen Schmerzen und das Todesrisiko des Tieres zu reduzieren.

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Protocol

Dieses Protokoll folgt den Tierhaltungsrichtlinien des Imagine Institute und wurde von Ethikkommissionen und dem französischen Ministerium validiert (APAFIS 26995).

1. Tiere

1. Bestimmen Sie die Anzahl der Tiere pro Gruppe. Wir empfehlen 12 Tiere pro Gruppe. Bestimmen Sie das Geschlecht und das Alter von Mäusen. Dieses Protokoll ist für 6 Wochen alte C57BL/6J-Mäuse (männlich oder weiblich) angepasst.
2. Geben Sie den Tieren, mindestens 1 Woche vor dem Eingriff, Nahrungsergänzungsmittelgel zur Akklimatisierung.

2. Chirurgischer Eingriff

1. Bereiten Sie das benötigte Material vor. Autoklavieren Sie die Instrumente: Schere, Nadeltreiber, Pinzette, Einsatz und Handstück des piezoelektrischen Knochenchirurgiegeräts und Aufzug. Bereiten Sie sterile Handschuhe, Seidennähte (4/0), Rasierer, Baumwollgaze, 10%ige Povidon-Jod-Lösung, Heiztisch, Isofluran und die Schnauzenmaske für die Isofluran-Inhalation vor.
2. Bereiten Sie Buprenorphin in einer Dosis von 0,1 mg/kg zu, verdünnt in sterilem injizierbarem physiologischem Serum. Verabreichen Sie Buprenorphin durch subkutane Injektion mit einer 25-G-Nadel 30 Minuten vor der Operation.
3. Bereiten Sie die Heizplatte (37 °C) vor, legen Sie eine Schaumstoffstütze darauf und fixieren Sie die Schnauzenmaske mit kleinen Nadeln oder Klebeband.
4. Platzieren Sie die Maus zur Induktion in den Isoflurantank mit Isoflurandiffusion (4%). Testen Sie die Anästhesietiefe, indem Sie eine Zehenklemme durchführen. Bei ausreichender Induktion ist ein Mangel an Pedalreflex zu beobachten.
5. Legen Sie die betäubte Maus auf den Rücken auf die Heizplatte, die mit einem sterilen Feld bedeckt ist, das während des gesamten Eingriffs bei 37 °C gehalten wird. Positionieren Sie die Maske auf der Schnauze, um kontinuierlich Isofluran zu inhalieren (Erhaltungstherapie bei 2,5%). Fixieren Sie die Extremitäten der Maus mit Klebeband.
6. Tragen Sie beidseitig Augengleitmittel auf, um Augentrockenheit zu verhindern, die durch Vollnarkose verursacht wird. Rasieren Sie das Unterkieferhaar, tragen Sie sterile Handschuhe und desinfizieren Sie die Haut mit mehreren Wischbewegungen aus 10%iger Povidon-Jod-Lösung und Alkohol.
7. Führen Sie den submandibulären kutanen Zugang wie unten beschrieben durch.
   1. Führen Sie mit einer Mikroschere einen Hautschnitt vom Unterkieferwinkel bis zum 1/3 posterior - 2/3 anterioren Übergang des horizontalen Astes des Unterkiefers durch.
   2. Präparieren Sie das Unterhautgewebe, um den Kaumuskel freizulegen.
8. Lösen Sie die Ansatzpunkte des Kaumuskels mit Hilfe eines Periostlifts vom unteren Rand des Unterkiefers.
9. Heben Sie den Kaumuskel in einer subperiostalen Ebene entlang des Unterkieferastes mit dem Aufzug an.
10. Anlegen einer kleinen Osteotomie (3 mm Länge) am unteren Rand des Unterkiefers mit dem piezoelektrischen Knochenchirurgiegerät unter Kochsalzlösung im Serum (maximal 10 ml/min) am unteren Rand des Unterkiefers, anterior zum Unterkieferwinkel, im hinteren Teil der Konkavität (Abbildung 1, Abbildung 2).
11. Lokalisieren Sie den hinteren Rand des Unterkiefers und der Coronoidkerbe (mit der Mikroschere oder der Pinzette) und vervollständigen Sie die Fraktur mit einer kleinen geraden Schere, die entlang des Unterkieferastes eingeführt wird, um zusätzliche Kaumuskelöffnungen und Verletzungen zu vermeiden. Um die korrekte Ausrichtung der Fraktur zu ermöglichen, platzieren Sie die Schere senkrecht zum unteren Rand des Unterkiefers.
12. Vergewissern Sie sich, dass die Fraktur vollständig ist: Die vollständige Beweglichkeit zwischen den beiden Knochensegmenten sollte während der weichen Mobilisierung der 2 Segmente mit einer Pinzette beobachtet werden.
13. Schließen Sie den Hautzugang mit Seidennähten (4/0) mit getrennten Nähten. Im Periost ist keine Naht erforderlich.
    HINWEIS: Alternativ kann der Hautzugang mit anderen nicht adsorbierbaren Nähten (z. B. Polypropylen-Nähten) vernäht werden.
14. Führen Sie kopfseitige Röntgenaufnahmen durch, um die Richtung der Fraktur zu bestätigen (Abbildung 3).
    1. Setzen Sie die Maus wieder in den Isofluran-Tank für eine kurze Reinduktion, bevor Sie die Röntgenaufnahmen durchführen. Platzieren Sie dann die Maus in der Verlängerung auf der lateralen Seite, wobei sich der Kopf für die Röntgenanalyse leicht in der Überstreckung befindet.
    2. Im Falle einer Fraktur, die zu anterior auf Höhe eines Unterkiefermolaren platziert wurde, oder wenn die Fraktur den Unterkieferwinkel ablöst (Abbildung 4), ist eine abnormale Zunahme des Volumens des Knochenkallus zu beobachten. Schließen Sie in diesen Fällen die Tiere aus der Studie aus, um Verzerrungen bei der Analyse zu vermeiden.
15. Überprüfen Sie die Mäuse, bis sie wieder zu Bewusstsein kommen, bevor Sie sie wieder in den Käfig setzen.

3. Nachsorge

1. Bereiten Sie einen Mäusekäfig ohne Kroketten und harte Anreicherung vor, um Kaukräfte zu vermeiden.
2. Isolieren Sie die operierte Maus in der 1^. Woche in einem einzigen Käfig, bis die Haut vollständig verheilt ist. 1 Woche nach der Operation operierte die Gruppe weibliche Mäuse zusammen im selben Käfig.
3. Verabreichen Sie Buprenorphin (0,1 mg/kg) durch subkutane Injektionen nach 4 Stunden, 24 Stunden, 48 Stunden und 72 Stunden nach dem Eingriff.
4. Füttern Sie Mäuse während aller postoperativen Perioden von Tag 0 bis zum Ende der Konsolidierungsperiode (d. h. 28 Tage) mit weichem Diätgel, um Schmerzen und sekundäre Verschiebungen der Fraktur zu vermeiden.
5. Wiegen Sie die Mäuse täglich von Tag 0 bis Tag 4 nach der Fraktur, morgens vor der Buprenorphin-Injektion und dann 3x pro Woche bis zur Tiertötung (14 Tage nach der Fraktur).
6. Bewerten Sie das postoperative Wohlbefinden der Tiere, um die postoperative Tierpflege zu optimieren. Verwenden Sie die Score-Skala in Tabelle 1 , um den postoperativen Zustand des Tieres zu bewerten und die Nachbeobachtung anzupassen. Wenn der Score > 1 beträgt, wird Buprenorphin injiziert, und wenn der Score > 3 beträgt und/oder bei einem Gewichtsverlust von > 20% des präoperativen Gewichts trotz Nahrungsanreicherung muss über Euthanasie gesprochen werden (Tabelle 1).

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Results

Was die chirurgischen Eingriffe in vivo betrifft, so ist für die optimale Durchführung dieses Verfahrens der nicht-stabilisierten Unterkieferfraktur im Mausmodell spezifisches Lernen und Training erforderlich.

Diese Technik für nicht stabilisierte Unterkieferfrakturen ermöglicht die Untersuchung des endochondralen Knochenreparaturprozesses. Nach der Euthanasie wurden Unterkieferproben in 4% Paraformaldehyd entnommen (24 h). Nach vollständiger Ent...

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Discussion

Die Technik ermöglicht die Realisierung von nicht-stabilisierten Unterkieferfrakturen im Mausmodell innerhalb eines minimalen offenen Zugangs in einer kurzen Eingriffszeit (ca. 10 min oder weniger). Dieses Kurzzeitverfahren begrenzt das Risiko der Morbidität und des Todes von Tieren, insbesondere bei Kleintieren wie Mäusen. Um vergleichbare Ergebnisse bei der Analyse des endochondralen Knochenreparaturprozesses zu erhalten, sollte besonders darauf geachtet werden, die Unterkieferfrakt...

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buprenorphine : Buprecare 0.3 mg/kg	Animalcare
Elevator OBWEGESER width 6mm Length 17,5cm	Collin Medical	HA 5905
Forceps : Pad Plate MORIA 11 cm N°5	MORIA	9906
Heating table Bioseblab 55 cm x 33 cm	Bioseblab	707
Needle HOLDER : Micro Halsey Needle Holder - Metal	LABODERM	21,100
Neo Clear	Merck Millipore, Darmstadt, Germany	109843
Ocry Gel Tube 10 g (eye lubricant)	tvm lab	3.70045E+12
Piezotome 2 ASS FINAL	ACTEON	X57402
Piezotome insert Piezocision PZ3	ACTEON	F87574
Scissors micro	MORIA	MC52
Silk sutures PERMA HAND SEIDE  / MERSILK	ETHICON	REF 18501G
Straight scissors	MORIA	4877A
Vetflurane (isoflurane) 250 ml	VIRBAC	VET066 (Centravet)