Immunmetabolische Schaltkreise in der Infektion zur Weiterentwicklung wirtsgerichteter Therapien

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll für das Design, die Konstruktion und die Bereitstellung eines tetracyclingesteuerten induzierbaren synthetischen Schaltkreises vorgestellt. Die Wirkung der synthetischen Schaltkreise auf die Parasiteneliminierung und die Zytokinexpression kann durch Kanalisierung der vorgestellten Pipeline untersucht werden. Dieses Protokoll ist relevant für Forscher, die synthetische Schaltkreise bei Infektionskrankheiten untersuchen.

Zusammenfassung

Der Immunstoffwechsel ist eine zentrale Determinante für das Fortschreiten der Leishmaniose. Der auf synthetischer Biologie basierende Ansatz hat als Schritt hin zu therapeutischen Interventionen, die auf wirtsassoziierte Faktoren abzielen, die Leishmaniose verursachen, große Aufmerksamkeit erregt. Die Synthetische Biologie befasst sich mit der orthogonalen und modularen Entwicklung genetischer Komponenten, um biologische Systeme präzise zu modulieren und Zellen neue Funktionen zu verleihen. In der vorliegenden Studie wurde die Aufklärung einer systematischen Pipeline für die Entwicklung eines induzierbaren Tetracyclin-kontrollierten (TetON)-basierten synthetischen Schaltkreises zum Ziel gesetzt, Succinatdehydrogenase als Therapeutikum zu liefern, um die Eliminierung intrazellulärer Leishmania-Parasiten zu erleichtern. Das skizzierte Protokoll beschreibt den Entwurf einer synthetischen Schaltung und deren anschließende Validierung. Die vorgeschlagene Strategie konzentriert sich auch auf den Einbau von synthetischen Schaltkreisen in das Plasmid-Rückgrat als Transportvehikel. Darüber hinaus wurden Verabreichungsmaschinen mit Polyplex-basierten Nanopartikeln für die Verabreichung synthetischer Schaltkreise in murinen Makrophagen-Zelllinien eingesetzt, ohne die zelluläre Morphologie zu beeinträchtigen. Es wurde eine Standardisierung der Methode zur Selektion transfizierter Zellen und zur Bestimmung der optimalen Induktionskonzentration für die Expression synthetischer Schaltkreise durchgeführt. Beobachtungen zeigen eine deutliche Verringerung der intrazellulären Parasitenlast in transfizierten Zellen im Vergleich zu infizierten Zellen. Proinflammatorische Zytokine wurden nach der Infektion in einem synthetischen Schaltkreis exprimiert, transfiziert und induzierte Zellen als Mechanismus zur Förderung der Parasiteneliminierung. Dies unterstreicht die auf synthetischer Biologie basierende Methode als wirksamen Ansatz bei Leishmaniose, indem sie auf Wirtsfaktoren abzielt, die mit dem Fortschreiten der Krankheit verbunden sind.

Einleitung

Die Weiterentwicklung der ganzheitlichen, integrativen Medizin ist ein bedeutender Zusammenhang, der zwischen metabolischen Veränderungen in Immunzellen und ihrer Fähigkeit, den Immunzellphänotyp bei Infektionskrankheiten zu modulieren, identifiziert wurde. Der Immunstoffwechsel bietet neue Perspektiven für die Aufklärung der Pathogenese der beim Menschen weit verbreiteten Infektionskrankheiten. Darüber hinaus bietet sie vielversprechende Techniken für die Entwicklung von Impfstoffen und Medikamenten, indem sie neue Ziele für Interventionen identifiziert¹. Die metabolische Reprogrammierung von Immunzellen wird bei verschiedenen Infektionskrankh....

Protokoll

1. Zellkultur von RAW264.7-Zellen

HINWEIS: Verwenden Sie niedrige Durchgangszahlen zum Experimentieren. Die RAW264.7-Zelllinie wurde vom National Cell Repository des Biotechnology Research Innovation Council-National Centre for cell Sciences (BRIC-NCCS) in Pune beschafft. Da es sich bei der RAW264.7-Zelllinie um eine Makrophagen-Zelllinie handelt, kann es vorkommen, dass sie sich mit zunehmenden Passagen zu differenzieren beginnt. Nach der Wiederbelebung der Zellen wird die Zelllinie nach 2 Passagen zur Transfektion verwendet.

1. Keimen Sie 5 x 10⁵ Zellen der RAW264.7-Zelllinie in einem 25^cm 2-K....

Ergebnisse

Die Anordnung der genetischen Teile, die den synthetischen Schaltkreis bilden, um den synthetischen Schaltkreis zu exprimieren, ist in (Abbildung 1A) dargestellt. Die entsprechenden Teile wurden in einem pEGFP-N1-Vektor orthogonal und modular kloniert, was in Abbildung 1B dargestellt ist. Die Simulation des synthetischen Schaltkreises zeigte die oszillatorische Dynamik sowohl in SDHA als auch im Tetracyclin-Repressor. Diese Beobachtung deutet auf ein reziprokes .......

Diskussion

Die erzielten Ergebnisse unterstreichen die Effizienz der Pipeline, die für das Design und die Implementierung eines synthetischen Kreislaufs kanalisiert wurde. Der Aufbau dieses synthetischen Schaltkreises war ein Schritt zur Entwicklung der Präzisionsmedizin für Infektionskrankheiten wie Leishmaniose. Durch die in silico Assemblierung genetischer Teile und deterministische Simulation wurde die ausgeprägte modulatorische Wirkung des TetON-Systems überwacht. Der Effekt der Schaltung könnte insbesondere zur.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 μL tips	Tarson	521050
10X restriction buffer	BioLabs	R0146S	Restriction digestion
1mL tips	Tarson	521016
1mL tube	Eppendorf	30121023
200 μL tips	Tarson	521010
25cm2 flask	Corning	430639	For cell culture
4',6-diamidino-2-phenylindole	ThermoFischer Scientific	D1306	nuclear staining
50mL tube	Corning	352070
60mm plates	Falcon	353002
6X TrackIt Cyan/Orange Loading buffer	ThermoFischer Scientific	10488085	Loading samples for AGE
96 well coverslip bottom plate	ThermoFischer Scientific	160376	For confocal imaging and transfection
96 well micro test plate flat bottom wells	Tarson	941196
Agarose	Sigma	A9539	For AGE
Agarose gel electrophoresis assembly	GeNei	93	For AGE
Bacterial laminar flow	ESCO Lifesciences	2120765	For transformation
Calcium chloride	Merck	C4901	Buffer /Reagent preparation
Cell culture laminar air flow	ThermoFischer Scientific	1323TS	For cell culture
Cell scraper	Genetix	90020	For cell culture
Cell spreader	Fischer Scientific	12822775
Centrifuge for 1.5mL tubes	Eppendorf	EP5404000537
Centrifuge for 50mL falcon	ThermoFischer Scientific	75004210
Chlorofrom	Fischer Scientific	67-66-3	For RNA isolation
CO2 incubator	ThermoFischer Scientific	3110	For cell culture
Cuvette	Eppendorf	6138000018	Estimation of plasmid concentration
CYTIVA IQ 500 gel imager	Cytiva	29655893	For AGE
DEPC TREATED H2O 1000 ML	ThermoFischer Scientific	750023	For RNA isolation
Doxycycline	Merck	33429	For induction of transfected cells
Dry heating block	Labnet		For transformation and inactivation of restriction enzymes
Dulbecco's Modified Eagle Medium	National centre for cell science		For cell culture
Ethanol	Sigma-Aldrich	1.00983	Buffer /Reagent preparation
Ethidium bromide	Sigma	E7637	For AGE
Ethylenediamine tetraacetic acid	Fischer Scientific	12635	Buffer /Reagent preparation
Evos brightfield microscope	ThermoFischer Scientific	AMEX1000
ExPasy	https://web.expasy.org/translate/		for contruction of synthetic circuit
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000-044	For cell culture
FV31S-SW software	Olypmus		Image acquisition
Geneticin	Gibco	1563411	for transfection
Gibson assembly method for cloning	BIOMATIK		Construction of synthetic circuit
Graphpad prism	Graphpad		Statistical analysis
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	ThermoFischer Scientific	4368814	for cDNA synthesis
Isopropanol	Fischer Scientific	13825	Buffer /Reagent preparation
Kanamycin	Sigma	60615	For transformation and colony selection
Luria Bertini broth	Himedia	M1245	For culturing E.coli
Magnesium chloride	Fischer Scientific	BP214	Buffer /Reagent preparation
Micro Filt Vertical Laminar Air Flow	Microfilt
MicroAmp Fast 8-Tube Strip, 0.1 mL	ThermoFischer Scientific	4358293	For qRT-PCR
MicroAmp Optical 8-Cap Strips	ThermoFischer Scientific	4323032	For qRT-PCR
Microwave oven	LG	MC-7649DW	For AGE
Mm00434228_m1 (IFN-γ)	ThermoFischer Scientific	4331182	Taqman probes
Mm00443258_m1 (TNF)	ThermoFischer Scientific	4331182	Taqman probes
Mm01321739_m1(TGFB)	ThermoFischer Scientific	4331182	Taqman probes
Mouse ELISA Kit IL-10	ThermoFischer Scientific	BMS614	For ELISA
Mouse ELISA Kit IL-12	ThermoFischer Scientific	BMS616	For ELISA
Multiskan Sky with Touch Screen + μDrop Plate	ThermoFischer Scientific	51119600DP	For ELISA
MX-M Microplate Mixers 96-well Cell Culture Plate Mixer Adjustable 0-1500 rpm Laboratory Shaker Agitator	DIAB
National centre for Biotechnology Information	https://www.ncbi.nlm.nih.gov		for contruction of synthetic circuit
Neubauer's chamber	Marienfeld superior	640010	For cell count
Non-vented 25cm2 flask	Corning	353014	For culturing parasite
NotI	BioLabs	R3189M	Restriction enzyme
Nuclease free water	Biodesign	1QIA	Reagent preparation
Olympus Cell Sens Dimension Desktop 2.3 software	Olypmus		Image processing
Olympus FV 3000	Olympus		For confocal imaging
OPTI-MEM media	Gibco	31985070	media for Transfection
pEGFP-N1 vector cloned with synthetic circuit	Biomatik
Penicillin	ThermoFischer Scientific	15070063	For cell culture
Polyethylenimine	MERCK	764965	for transfection
Potassium Acetate	Fischer Scientific	YBP364500	Buffer /Reagent preparation
Potassium Chloride	Fischer Scientific	BP366	Buffer /Reagent preparation
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma	P5655	Buffer /Reagent preparation
Power supply pack	BIORAD	1645070	For AGE
Registry of Standard Biological parts	https://parts.igem.org/Main_Page		for contruction of synthetic circuit
RNAiso Plus	Takara	38220090	For RNA isolation
RNase A	ThermoFischer Scientific	12091021	Buffer /Reagent preparation
Roswell Park Memorial Institute Medium	National centre for cell science		For culturing parasite
Shaker incubator	REMI	CIS 24 plus	For culturing E.coli
Sodium chloride	Qualigens	Q27605	Buffer /Reagent preparation
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L3771	Buffer /Reagent preparation
Sodium Hydroxide	Fischer Scientific	15895	Buffer /Reagent preparation
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma	S5136	Buffer /Reagent preparation
Spectrophotometer	Eppendorf		Estimation of plasmid concentration
Spin win	Trason	1020
StepOne plus Real Time PCR system	Life technologies	272006777	For qRT-PCR
StepOne software version 2.3	Life technologies		For qRT-PCR
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2X), no AmpErase UNG	ThermoFischer Scientific	4366072
Tinker cell			Synthetic circuit construction and simulation
TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder	ThermoFischer Scientific	10488085	For AGE
Tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride	Himedia	MB029	Buffer /Reagent preparation
Tris-acetate-EDTA	SERVA	42549.1	Buffer /Reagent preparation
Trypan blue	Sigma	T8154	For cell count
XhoI	BioLabs	R0146S	Restriction enzyme