Immunfärbung und automatische Zählung von retinalen Ganglienzellen der Maus

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Isolierung der Netzhaut der gesamten Maus und zur Durchführung einer Immunfärbung zur Markierung aller retinalen Ganglienzellen (RGCs). Dem Prozess folgt die Bildgebung und automatische Zählung von RGCs mit KI-basierter Software, die eine einfache, schnelle und genaue Methode zur Quantifizierung von RGCs in der gesamten Netzhaut der Maus bietet.

Zusammenfassung

Das Glaukom ist weltweit eine der Hauptursachen für Erblindung und zeichnet sich durch einen komplexen pathogenen Mechanismus aus, der die Wiederherstellung des Sehvermögens erschwert. Mäuse dienen aufgrund ihres relativ homogenen genetischen Hintergrunds und der retinalen Ganglienzellen (RGCs), die strukturell denen des Menschen ähneln, als wertvolle Tiermodelle für die Erforschung der Pathogenese und Behandlung des Glaukoms. Eine genaue Beurteilung der RGC-Schädigung und der Behandlungsergebnisse in Maus-Glaukommodellen erfordert die Bestimmung der RGC-Zahl über die gesamte Netzhaut. Dieses Protokoll beschreibt eine umfassende Methode, die die Isolierung der gesamten Netzhaut, die Markierung von RGCs mit spezifischen Antikörpern und die schnelle, genaue automatische Zählung von RGCs mit einem KI-basierten Programm umfasst. Der optimierte Ansatz ermöglicht eine effiziente und präzise Quantifizierung der RGC-Anzahl in der Netzhaut von Mäusen und erleichtert so die Bewertung der RGC-Degeneration und möglicher therapeutischer Interventionen. Indem es Forschern ermöglicht, das Ausmaß der RGC-Schädigung zu beurteilen, trägt dieses Protokoll zu einem tieferen Verständnis der Glaukom-Pathogenese bei und hilft bei der Entwicklung wirksamer Behandlungsstrategien zur Behandlung und Vorbeugung von Sehverlust.

Einleitung

Das Glaukom ist durch das fortschreitende Absterben von Ganglienzellen gekennzeichnet, was eine große Herausforderung für die Wiederherstellung des Sehvermögens darstellt ^1,2. Diese Krankheit steht aufgrund ihrer Prävalenz und ihres Einflusses auf das Sehvermögen im Mittelpunkt der Augenforschung³. Mausmodelle sind beim Glaukom unverzichtbar
Forschung aufgrund ihres homogenen genetischen Hintergrunds, ihrer hohen Fortpflanzungsfähigkeit und der Ähnlichkeit ihrer Ganglienzelleigenschaften mit denen des Menschen⁴. Das primäre Ziel dieser Methode ist die genaue Quantifizierung von retinalen Ganglienzellen (RGCs) in Mausmodellen, was für das Verständnis der Pathogenese des Glaukoms und die Entwicklung relevanter Therapien unerlässlich ist.

Der Grund für die Entwicklung dieser Technik ergibt sich aus dem Bedarf an einer zuverlässigen und effizienten Methode zur Beurteilung der RGC-Degeneration in Mausmodellen. Traditionelle Methoden, wie z. B. die Markierung von RGCs in Netzhautschnitten, liefern aufgrund der ungleichmäßigen Verteilung der RGCs in der Netzhaut oft unzuverlässige Ergebnisse⁵. Die Quantifizierung von RGCs über die gesamte Netzhaut spiegelt Veränderungen in ihrer Anzahl besser wider und ist entscheidend für die Bewertung des Krankheitsverlaufs und therapeutischer Interventionen.

Diese Methode bietet mehrere Vorteile gegenüber alternativen Techniken. Zum Beispiel kann die manuelle Zählung von retinalen Ganglienzellen (RGCs) in einer normalen adulten Mausnetzhaut, die 40.000 bis 60.000 RGCs enthält, zeitaufwändig und fehleranfällig sein ^6,7,8. Die von uns entwickelte Software für die automatische RGC-Zählung ermöglicht eine genaue Zählung in weniger als 3 Minuten, was den Forschern möglicherweise eine erhebliche Zeitersparnis bringt. Darüber hinaus minimiert die KI-basierte Software, die für die automatische Zählung verwendet wird, Verzerrungen und verbessert die Reproduzierbarkeit.

Darüber hinaus bietet diese Technik einen standardisierten Ansatz zur Bewertung der RGC-Degeneration über verschiedene Mausmodelle und experimentelle Bedingungen hinweg und liefert wertvolle Daten für die Glaukomforschung. Die Methode steht im Einklang mit anderen Studien, die die Bedeutung der Whole-Mount-Netzhautanalyse für das Verständnis von Netzhautveränderungen bei Krankheiten betonen⁹.

Um den Lesern bei der Entscheidung zu helfen, ob diese Methode für ihre Anwendung geeignet ist, ist es wichtig zu beachten, dass diese Technik besonders vorteilhaft für Forscher ist, die die Degeneration von retinalen Ganglienzellen (RGC) in Mausmodellen für Glaukom oder andere Netzhauterkrankungen untersuchen. Die Methode ist an verschiedene Versuchsaufbauten anpassbar und bietet ein hohes Maß an Genauigkeit und Effizienz bei der RGC-Zählung, wodurch sie sich sowohl für kleine als auch für große Studien eignet. Darüber hinaus machen das unkomplizierte Design des Protokolls und die Verfügbarkeit benutzerfreundlicher Software es für Forscher mit unterschiedlichem Fachwissen in der Netzhautanalyse zugänglich.

Protokoll

Das Verfahren entsprach den Richtlinien der Association for Research in Vision and Ophthalmology für die Verwendung von Tieren in der Forschung und wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Sichuan Provincial People's Hospital genehmigt. In dieser Studie wurden männliche C57Bl/6J-Mäuse (2 Monate alt) verwendet. Abbildung 1 veranschaulicht das hier beschriebene Gesamtverfahren. Die Einzelheiten zu den verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Isolierung von Whole-Mount-Netzhäuten

1. Tieropfer
   1. Töteten Sie die Mäuse mittels zervikaler Dislokation (nach institutionell anerkannten Protokollen) (Abbildung 2A). Vor einer zervikalen Luxation,
      Betäuben Sie die Mäuse durch Inhalation von Isofluran (3%-5% Sauerstoff) oder durch intraperitoneale Injektion des Ketamin/Xylazin-Gemisches.
2. Enukleation und Augapfelverarbeitung
   1. Markieren Sie den Rand der Hornhaut auf der dorsalen Seite des Augapfels mit einem blauen Marker, um sich die Ausrichtung bei der anschließenden Dissektion zu merken.
   2. Entfernen Sie mit einer Schere das restliche Muskelgewebe, das am Augapfel befestigt ist. Übertragen Sie den enukleierten Augapfel für eine kurze Spülung in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit rundem Boden, das mit 1x PBS gefüllt ist (Abbildung 2C).
3. Fixierung
   1. Übertragen Sie den Augapfel in ein weiteres 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit rundem Boden, das frisch hergestelltes 4 % Paraformaldehyd (PFA) enthält, und fixieren Sie es 10 Minuten lang bei 4 °C (Abbildung 2D).
   2. Machen Sie mit einer feinen Schere unter einem Präpariermikroskop einen kleinen Schnitt (ca. 1-2 mm) an der Hornhaut.
   3. Setzen Sie den Augapfel für eine weitere Fixierung bei 4 °C für 3 Stunden wieder in das Fixiermittel ein, um die Gewebemorphologie zu erhalten (Abbildung 2D).
4. Entfernung von Hornhaut und Linse ^1,9
   1. Machen Sie mit einer feinen chirurgischen Schere einen kleinen Schnitt von ca. 1 mm um den Hornhautlimbus, die Grenze zwischen Hornhaut und Sklera.
   2. Schneiden Sie vorsichtig um den Umfang der Hornhaut herum und schneiden Sie sie vollständig aus, um die darunter liegenden Strukturen freizulegen.
   3. Verwenden Sie eine feine Pinzette, um die Linse vorsichtig zu greifen und vorsichtig vom umgebenden Gewebe abzuheben, um Schäden an der Netzhaut zu vermeiden. Bewahren Sie die strukturelle Integrität der Netzhaut mit einer behutsamen Operation.
   4. Übertragen Sie die Augenmuschel zur weiteren Verarbeitung in ein Mikrozentrifugenröhrchen.
      HINWEIS: Schneiden Sie die Hornhaut heraus und extrahieren Sie die Linse effizienter mit der "Kreuzschlitz"-Technik¹⁰. Machen Sie zwei senkrechte Schlitze über die Hornhaut und ziehen Sie die Linse mit einer Pinzette heraus.
5. Skleralschnitt
   1. Schneiden Sie mit einer feinen Augenschere einen präzisen Schlitz in die Sklera, um die nachfolgenden Dissektionsschritte zu erleichtern (Abbildung 2J).
6. Trennung der Netzhaut
   1. Führen Sie eine Pinzette mit Zähnen in den Schnitt zwischen Sklera und Netzhaut ein. Fassen Sie vorsichtig den Rand der Sklera an und vermeiden Sie übermäßige Gewalt, um ein Reißen des Gewebes zu verhindern.
   2. Vergrößern Sie den Schnitt allmählich, indem Sie die Pinzette mit langsamen, gleichmäßigen Handbewegungen entlang der Grenze zwischen Sklera und Netzhaut bewegen. Trennen Sie die Sklera vorsichtig mit dem gezahnten Teil der Pinzette von der Netzhaut, um sicherzustellen, dass die Netzhaut nicht beschädigt wird (Abbildung 2J).
7. Schneiden der Netzhaut
   1. Teile die Netzhaut mit einer scharfen Schere in vier etwa gleich große Lappen. Stellen Sie sicher, dass die Schnitte etwa auf halbem Weg zum Sehnerv und im 90°-Winkel zueinander ausgerichtet sind.
8. Reinigung der Netzhaut
   1. Falten Sie die präparierte Netzhaut vorsichtig mit einer Bürste mit weichen Borsten auseinander und entfernen Sie sorgfältig Schmutz von der Oberfläche (Abbildung 2K).
9. Endgültige Fixierung
   1. Übertragen Sie die isolierte Netzhaut mit einer Einweg-Pasteurpipette in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit frischem 4 % PFA. Lassen Sie die Fixierung auf Eis für weitere 5 Stunden bis über Nacht zur Gewebekonservierung zu.

2. Immunfärbung

1. Waschen
   1. Waschen Sie die isolierte Whole-Mount-Retina in 1x PBS unter leichtem Rühren für 5 min. Verwerfen Sie die PBS-Lösung. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal, um Reste des Fixiermittels und Ablagerungen zu entfernen.
2. Blockierend
   1. Tauchen Sie die gewaschene Netzhaut 30 Minuten lang in eine Blockierungspufferlösung (1x PBS mit 4 % normalem Eselsserum (NDS) und 0,2 % Triton X-100), um eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern und die Permeabilisierung zu verbessern (Abbildung 3A).
3. Inkubation von Primärantikörpern
   1. Ersetzen Sie den Blockierungspuffer durch den primären Antikörper BRN3A (im Blockierungspuffer 1:200 verdünnt). Die Netzhaut wird über Nacht bei 4 °C inkubiert, um eine spezifische Antigen-Antikörper-Bindung zu ermöglichen (Abbildung 3B).
4. Waschen
   1. Waschen Sie die Netzhaut dreimal mit 1x PBS für jeweils 5 Minuten, um ungebundene Primärantikörper zu entfernen und Hintergrundverfärbungen zu reduzieren (Abbildung 3C).
5. Inkubation von sekundären Antikörpern
   1. Inkubieren Sie die Netzhaut mit Alexa594- oder Alexa488-konjugiertem Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (verdünnt 1:300) für 2 Stunden bei Raumtemperatur, um Zielantigene sichtbar zu machen (Abbildung 3D).
6. Waschen
   1. Führen Sie drei aufeinanderfolgende Waschungen mit 1x PBS für jeweils 5 Minuten durch, um überschüssige Sekundärantikörper zu entfernen und unspezifische Bindungen zu minimieren.
7. Montage
   1. Übertragen Sie die immungefärbte Netzhaut vorsichtig auf einen Objektträger aus Glas und glätten Sie ihn vorsichtig, um Falten oder Verzerrungen zu minimieren.
   2. Tragen Sie einen kleinen Tropfen Anti-Fade-Eindeckmittel auf die Mitte der Netzhaut auf und sorgen Sie für eine gleichmäßige Verteilung im Gewebe.
   3. Positionieren Sie vorsichtig ein Deckglas über der montierten Netzhaut und vermeiden Sie dabei Luftblasen (Abbildung 3E,F).

3. Bildbearbeitung

HINWEIS: Importieren Sie das Bild in die automatische Zählsoftware RGC und beginnen Sie mit der Zählung. Die Anzahl der BRN3A-positiven Zellen für die gesamte Netzhaut kann in wenigen Minuten ermittelt werden. Laden Sie die AutoCount-Software von GitHub (https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs) herunter. Befolgen Sie die detaillierten Installationsschritte für die Software unten:

1. Laden Sie den Code über den GitHub-Link herunter. Man erhält eine Datei mit dem Namen "Intelligent-quantifying-RGCs.zip". Entpacken Sie diese Datei.
2. Laden Sie die erforderlichen Dateien von der Cloud-Festplatte herunter (siehe Materialtabelle) und entpacken Sie sie. Die heruntergeladene Datei hat den Namen "yolov5_cpu". Entpacken Sie dieses Paket in den aktuellen Ordner, um unerwartete Probleme zu vermeiden.
3. Suchen Sie die Konfigurationsdatei aus Schritt 1, und ändern Sie ihren Inhalt so, dass er auf den Pfad "yolov5_cpu" verweist.
   HINWEIS: Wenn das heruntergeladene "yolov5_cpu" beispielsweise in "D:\1me\yolov5_cpu_" abgelegt ist, ändern Sie die Datei "config.ini" in Schritt 1 in "D:/1me/yolov5_cpu" (verwenden Sie / anstelle von \). (Abbildung 4A).
4. Öffnen Sie die grafische Oberfläche, indem Sie auf userinterface.exe klicken. Der erste Ladevorgang kann langsam sein (als Administrator ausführen) (Abbildung 4B).
5. Überprüfen Sie nach dem Öffnen der Software, ob die Modelldatei "pmse_plus.pt" im Stammverzeichnis von Laufwerk C vorhanden ist. Wenn es nicht vorhanden ist, kopieren Sie es in dieses Verzeichnis.
   HINWEIS: Die Modelldatei "pmse_plus.pt" befindet sich im Ordner weights des Ordners "yolov5", der sich im extrahierten Ordner "Intelligent-quantifying RGCs" befindet (Abbildung 4C).
6. Bereiten Sie die Bilder vor, die erkannt werden sollen.
   HINWEIS: Die Software erlaubt es, nur ein oder fünf Bilder gleichzeitig zu lesen. Wenn Sie mehr lesen, wird ein Fehler angezeigt.

4. Automatisierte Zellzählung

1. Öffnen Sie die Zählsoftware (Abbildung 5A).
2. Klicken Sie auf BILD ÖFFNEN , um das Bild zu importieren (Abbildung 5B).
3. Klicken Sie auf RUN , damit die Software die Zellen automatisch zählt (Abbildung 5C).
   HINWEIS: Die Software markiert die gezählten Zellen mit einem roten quadratischen Feld und zeigt die Zellzahl in der oberen rechten Ecke an (Abbildung 5D).

Ergebnisse

Dieses Protokoll beschreibt die Methodik für die Ganz-Mount-Immunfärbung der Netzhaut von Mäusen, die eine sorgfältige Gewebevorbereitung, eine präzise Antikörperinkubation und eine zuverlässige automatisierte Zellzählung gewährleistet. Das Verfahren ermöglicht eine robuste Markierung und Quantifizierung von retinalen Ganglienzellen (RGCs) und ermöglicht so eine genaue Beurteilung von Zellpopulationen in verschiedenen experimentellen Kontexten. Die Methode wurde zur Zählung v...

Diskussion

Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Bestimmung aller retinalen Ganglienzellen (RGCs) in einer Mausnetzhaut, die zur Überwachung des Fortschreitens der RGC-Degeneration in Mausmodellen für Glaukomstudien verwendet werden kann. Die Netzhaut der Maus ist ein empfindliches Nervengewebe⁵, und das Isolieren der gesamten Netzhaut aus den Augen der Maus erfordert wiederholtes Üben. Während der Experimente wurde festgestellt, dass die Fixationszeit die Morphologie...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1× PBS	Servicebio	G4202
Alexa594-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG  (H+L)	ThermoFisher	A-11012
Anti-BRN3A antibody [EPR23257-285]	Abcam	ab245230
AutoCount software			https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs
Cloud disk	Google drive link		https://drive.google.com/file/d/1yOEsBvil6KEdZFa5ENQxB6
Cloud disk	Baidu link	Extraction code: g44k	https://pan.baidu.com/s/1lccg1OVbeudsp2VtnqxWZg
Marker	Sharpie
Normal Donkey Serum	Biosharp, Labgic	25030081
Paraformaldehyde	Macklin	P804536
ProClean 300	Beyotime	ST853
Sucrose	BBI, Sangon	A610498
Triton X-100	BioFroxx, neoFroxx	1139ML100