Immunfärbung und automatische Zählung von retinalen Ganglienzellen der Maus

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Isolierung der Netzhaut der gesamten Maus und zur Durchführung einer Immunfärbung zur Markierung aller retinalen Ganglienzellen (RGCs). Dem Prozess folgt die Bildgebung und automatische Zählung von RGCs mit KI-basierter Software, die eine einfache, schnelle und genaue Methode zur Quantifizierung von RGCs in der gesamten Netzhaut der Maus bietet.

Zusammenfassung

Das Glaukom ist weltweit eine der Hauptursachen für Erblindung und zeichnet sich durch einen komplexen pathogenen Mechanismus aus, der die Wiederherstellung des Sehvermögens erschwert. Mäuse dienen aufgrund ihres relativ homogenen genetischen Hintergrunds und der retinalen Ganglienzellen (RGCs), die strukturell denen des Menschen ähneln, als wertvolle Tiermodelle für die Erforschung der Pathogenese und Behandlung des Glaukoms. Eine genaue Beurteilung der RGC-Schädigung und der Behandlungsergebnisse in Maus-Glaukommodellen erfordert die Bestimmung der RGC-Zahl über die gesamte Netzhaut. Dieses Protokoll beschreibt eine umfassende Methode, die die Isolierung der gesamten Netzhaut, die Markierung von RGCs mit spezifischen Antikörpern und die schnelle, genaue automatische Zählung von RGCs mit einem KI-basierten Programm umfasst. Der optimierte Ansatz ermöglicht eine effiziente und präzise Quantifizierung der RGC-Anzahl in der Netzhaut von Mäusen und erleichtert so die Bewertung der RGC-Degeneration und möglicher therapeutischer Interventionen. Indem es Forschern ermöglicht, das Ausmaß der RGC-Schädigung zu beurteilen, trägt dieses Protokoll zu einem tieferen Verständnis der Glaukom-Pathogenese bei und hilft bei der Entwicklung wirksamer Behandlungsstrategien zur Behandlung und Vorbeugung von Sehverlust.

Einleitung

Das Glaukom ist durch das fortschreitende Absterben von Ganglienzellen gekennzeichnet, was eine große Herausforderung für die Wiederherstellung des Sehvermögens darstellt ^1,2. Diese Krankheit steht aufgrund ihrer Prävalenz und ihres Einflusses auf das Sehvermögen im Mittelpunkt der Augenforschung³. Mausmodelle sind beim Glaukom unverzichtbar
Forschung aufgrund ihres homogenen genetischen Hintergrunds, ihrer hohen Fortpflanzungsfähigkeit und der Ähnlichkeit ihrer Ganglienzelleigenschaften mit denen des Menschen⁴. Das primäre Zi....

Protokoll

Das Verfahren entsprach den Richtlinien der Association for Research in Vision and Ophthalmology für die Verwendung von Tieren in der Forschung und wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Sichuan Provincial People's Hospital genehmigt. In dieser Studie wurden männliche C57Bl/6J-Mäuse (2 Monate alt) verwendet. Abbildung 1 veranschaulicht das hier beschriebene Gesamtverfahren. Die Einzelheiten zu den verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Isolierung von Whole-Mount-Netzhäuten

....

Diskussion

Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Bestimmung aller retinalen Ganglienzellen (RGCs) in einer Mausnetzhaut, die zur Überwachung des Fortschreitens der RGC-Degeneration in Mausmodellen für Glaukomstudien verwendet werden kann. Die Netzhaut der Maus ist ein empfindliches Nervengewebe⁵, und das Isolieren der gesamten Netzhaut aus den Augen der Maus erfordert wiederholtes Üben. Während der Experimente wurde festgestellt, dass die Fixationszeit die Morphologie.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1× PBS	Servicebio	G4202
Alexa594-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG  (H+L)	ThermoFisher	A-11012
Anti-BRN3A antibody [EPR23257-285]	Abcam	ab245230
AutoCount software			https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs
Cloud disk	Google drive link		https://drive.google.com/file/d/1yOEsBvil6KEdZFa5ENQxB6
Cloud disk	Baidu link	Extraction code: g44k	https://pan.baidu.com/s/1lccg1OVbeudsp2VtnqxWZg
Marker	Sharpie
Normal Donkey Serum	Biosharp, Labgic	25030081
Paraformaldehyde	Macklin	P804536
ProClean 300	Beyotime	ST853
Sucrose	BBI, Sangon	A610498
Triton X-100	BioFroxx, neoFroxx	1139ML100