Quantitative Analyse von Vitamin-A-Metaboliten in okulärem und nicht-okulärem Gewebe von Mäusen mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

Zusammenfassung

Hier wird ein Normalphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographieverfahren beschrieben, um kritische Retinoide zu detektieren und zu quantifizieren, die an der Erleichterung der Sehfunktion sowohl im Augengewebe als auch im systemischen Gewebe beteiligt sind, im Rahmen der systemischen Vitamin-A-Versorgung zur Erzeugung des essentiellen lichtempfindlichen Rhodopsin-Chromophors 11-cis-Retinal.

Zusammenfassung

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind eine Superfamilie von Transmembranproteinen, die Signalkaskaden durch Aktivierung ihres G-Proteins bei Assoziation mit ihrem Liganden auslösen. In der Sicht aller Säugetiere ist Rhodopsin das GPCR, das für die Initiierung der Phototransduktionskaskade verantwortlich ist. Innerhalb der Photorezeptoren ist Rhodopsin an sein Chromophor 11-cis-Retinal gebunden und wird durch die lichtempfindliche Isomerisierung von 11-cis-Retinal zu all-trans-Retinal aktiviert, wodurch das Transducin-G-Protein aktiviert wird, was zur Phototransduktionskaskade führt.

Während die Phototransduktion gut verstanden ist, sind die Prozesse, die an der Versorgung mit Vitamin-A-Vorläufern in der Nahrung für die 11-cis-Retinal-Bildung im Auge beteiligt sind, sowie Krankheiten, die zu einer Störung dieser Versorgung führen, noch nicht vollständig verstanden. Sobald Vitamin-A-Vorläufer in den Darm aufgenommen wurden, werden sie in der Leber als Retinylester gespeichert und als All-trans-Retinol, das an das Retinol-bindende Protein 4 (RBP4) gebunden ist, in den Blutkreislauf abgegeben. Dieses zirkulatorische RBP4-Retinol wird von systemischen Organen wie Leber, Lunge, Niere und Auge aufgenommen. Daher ist eine Methode zur Quantifizierung der verschiedenen Metaboliten von Vitamin A in der Nahrung im Auge und in den systemischen Organen von entscheidender Bedeutung für die Untersuchung der ordnungsgemäßen Funktion von Rhodopsin GPCR.

In dieser Methode stellen wir eine umfassende Extraktions- und Analysemethode für die Vitamin-A-Analytik in murinem Gewebe vor. Durch die Normalphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie können alle relevanten Isomere von Retinaldehyden, Retinolen und Retinylestern gleichzeitig in einem einzigen Lauf nachgewiesen werden, was die effiziente Verwendung von Versuchsproben ermöglicht und die interne Zuverlässigkeit verschiedener Vitamin-A-Metaboliten innerhalb derselben Probe erhöht. Mit dieser umfassenden Methode werden die Forscher in der Lage sein, die systemische Vitamin-A-Versorgung in der GPCR-Funktion von Rhodopsin besser zu beurteilen.

Einleitung

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind eine der am besten untersuchten und charakterisierten Superfamilien von bekannten Proteinen. In ihrer bekanntesten Funktion dienen GPCRs als Zelloberflächenrezeptor bei der Signaltransduktion und initialisieren intrazelluläre Reaktionen bei der Bindung an einen bestimmten Liganden. GPCRs zeichnen sich durch sieben helikale Transmembrandomänen (TM) und sechs Gesamtschleifendomänen aus. Von den sechs Schleifen sind drei Schleifen extrazellulär orientiert, um die Ligandenbindung zu erleichtern, während die anderen drei intrazellulären Schleifen an ein heterotrimeres G-Protein gekoppelt sind, d....

Protokoll

HINWEIS: Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Minnesota (Protokoll # 2312-41637A) genehmigt und in Übereinstimmung mit der ARVO-Erklärung für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung durchgeführt. Führen Sie alle Extraktionen im Dunkeln unter einem schwachen roten Licht zur Beleuchtung durch. Achten Sie auf das Restlicht, das von Instrumentendisplays und Zubehör-LEDs abgegeben wird.

1. Erzeugung von spektrophotometrischen Retinoid-Standards und externen Standardkurven

HINWEIS: Bereiten Si....

Diskussion

Bei dieser Methode wird die Normalphasen-HPLC verwendet, um relevante Retinoide, einschließlich Retinylester, Retinaldehyde und Retinole, nachzuweisen und zu quantifizieren. Angesichts der Bedeutung von 11-cis-Retinal als kritischem Chromophor bei der Aktivierung des Rhodopsin-GPCR ist eine Methode, die die Metaboliten nachweisen kann, die mit der Produktion von 11-cis-Retinal in Verbindung stehen, entscheidend für die Untersuchung der gesamten Sehfunktion. Der Hauptv.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
1-Octanol, suitable for HPLC, ≥99.5%	Sigma-Aldrich, Millipore Sigma	203-917-6
1,4-Dioxane, suitable for HPLC, ≥99.5%	Sigma-Aldrich, Millipore Sigma	204-661-8
11-cis-retinal	National Eye Institute	N/A
11-cis-Retinol	Toronto Research Chemicals	TRC-R252105
13-cis-retinal	Toronto Research Chemicals	TRC-R239900
13-cis-retinol	Toronto Research Chemicals	TRC-R252110
All-trans-Retinal	Toronto Research Chemicals	TRC-R240000
All-trans-Retinol	Toronto Research Chemicals	TRC-R252002
Ethyl Acetate, suitable for HPLC, ≥99.7%	Sigma-Aldrich, Millipore Sigma	205-500-4
Hexane, HPLC Grade	Fisher Scientific, Spectrum Chemical	18-610-808
Methanol (HPLC)	Fisher Scienctific	A452SK-4
Retinyl Palmitate	Toronto Research Chemicals	TRC-R275450
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)	Fisher Scientific	S271-500
Instruments
1260 Infinity II Analytical Fraction Collector	Agilent	G1364F
1260 Infinity II Binary Pump	Agilent	G7112B
1260 Infinity II Diode Array Detector	Agilent	G7115A
1260 Infinity II Multicolumn Thermostat	Agilent	G7116A
1260 Infinity II Vialsampler	Agilent	G7129A
ST40R Refrigerated Centrifuge	Thermo Scientific	TSST40R
Vacufuge Plus Centrifuge Concentrator	Eppendorf	22820168
Consumables
2 mL Amber Screw Top Vials	Agilent	5188-6535
Crimp Cap with PTFE/red rubber septa, 11 mm	Agilent	5183-4498
Disposable Glass Conical Centrifuge Tubes	Millipore Sigma	CLS9950215
Screw cap tube, 15 mL	Sarstedt	62.554.502
Vial insert, 150 µL, glass with polymer feet	Agilent	5183-2088