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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier wird ein Normalphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographieverfahren beschrieben, um kritische Retinoide zu detektieren und zu quantifizieren, die an der Erleichterung der Sehfunktion sowohl im Augengewebe als auch im systemischen Gewebe beteiligt sind, im Rahmen der systemischen Vitamin-A-Versorgung zur Erzeugung des essentiellen lichtempfindlichen Rhodopsin-Chromophors 11-cis-Retinal.

Zusammenfassung

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind eine Superfamilie von Transmembranproteinen, die Signalkaskaden durch Aktivierung ihres G-Proteins bei Assoziation mit ihrem Liganden auslösen. In der Sicht aller Säugetiere ist Rhodopsin das GPCR, das für die Initiierung der Phototransduktionskaskade verantwortlich ist. Innerhalb der Photorezeptoren ist Rhodopsin an sein Chromophor 11-cis-Retinal gebunden und wird durch die lichtempfindliche Isomerisierung von 11-cis-Retinal zu all-trans-Retinal aktiviert, wodurch das Transducin-G-Protein aktiviert wird, was zur Phototransduktionskaskade führt.

Während die Phototransduktion gut verstanden ist, sind die Prozesse, die an der Versorgung mit Vitamin-A-Vorläufern in der Nahrung für die 11-cis-Retinal-Bildung im Auge beteiligt sind, sowie Krankheiten, die zu einer Störung dieser Versorgung führen, noch nicht vollständig verstanden. Sobald Vitamin-A-Vorläufer in den Darm aufgenommen wurden, werden sie in der Leber als Retinylester gespeichert und als All-trans-Retinol, das an das Retinol-bindende Protein 4 (RBP4) gebunden ist, in den Blutkreislauf abgegeben. Dieses zirkulatorische RBP4-Retinol wird von systemischen Organen wie Leber, Lunge, Niere und Auge aufgenommen. Daher ist eine Methode zur Quantifizierung der verschiedenen Metaboliten von Vitamin A in der Nahrung im Auge und in den systemischen Organen von entscheidender Bedeutung für die Untersuchung der ordnungsgemäßen Funktion von Rhodopsin GPCR.

In dieser Methode stellen wir eine umfassende Extraktions- und Analysemethode für die Vitamin-A-Analytik in murinem Gewebe vor. Durch die Normalphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie können alle relevanten Isomere von Retinaldehyden, Retinolen und Retinylestern gleichzeitig in einem einzigen Lauf nachgewiesen werden, was die effiziente Verwendung von Versuchsproben ermöglicht und die interne Zuverlässigkeit verschiedener Vitamin-A-Metaboliten innerhalb derselben Probe erhöht. Mit dieser umfassenden Methode werden die Forscher in der Lage sein, die systemische Vitamin-A-Versorgung in der GPCR-Funktion von Rhodopsin besser zu beurteilen.

Einleitung

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind eine der am besten untersuchten und charakterisierten Superfamilien von bekannten Proteinen. In ihrer bekanntesten Funktion dienen GPCRs als Zelloberflächenrezeptor bei der Signaltransduktion und initialisieren intrazelluläre Reaktionen bei der Bindung an einen bestimmten Liganden. GPCRs zeichnen sich durch sieben helikale Transmembrandomänen (TM) und sechs Gesamtschleifendomänen aus. Von den sechs Schleifen sind drei Schleifen extrazellulär orientiert, um die Ligandenbindung zu erleichtern, während die anderen drei intrazellulären Schleifen an ein heterotrimeres G-Protein gekoppelt sind, das aus den Untereinheiten Gα, Gβ und Gγbesteht 1,2.

GPCRs werden in mehrere Klassen eingeteilt, darunter Rhodopsin-ähnliche Klassen der Klasse A, Klasse-B-Secretin-Rezeptorfamilie, Klasse-C-Glutamat, Klasse-D-Pilzpaarungs-Pheromonrezeptoren, zyklische AMP-Rezeptoren der Klasse E und Klasse F gekräuselte/geglättete 3,4. Wie der Name schon sagt, umfasst die GPCR-Rhodopsin-ähnliche Unterklasse der Klasse A Rhodopsin, das kritische GPCR, das für die Phototransduktion und die Sehfunktion verantwortlich ist. Rhodopsin enthält alle relevanten Schlüsselmerkmale und Strukturelemente, die im kanonischen Modell der GPCRs zu finden sind, einschließlich der zuvor erwähnten sieben helikalen TM-Domänen, der sechs extrazellulären und intrazellulären Schleifen und der Assoziation mit einem heterotrimeren G-Protein, das auch als Transducin (G t) in den Photorezeptoren bekanntist 1,5,6,7. Innerhalb der Bindungstasche von Rhodopsin bindet 11-cis-Retinal, der lichtempfindliche Chromophor-Ligand, über eine kovalente Schiff-Basenbindung an Rhodopsin an Lysin 296 und bildet so 11-cis-Retinyliden 1,8. Bei der Absorption eines Photons wird 11-cis-Retinyliden zu all-trans-Retinyliden photoisomerisiert, wodurch eine Konformationsänderung innerhalb von Rhodopsin induziert wird. Daher ist der 11-cis-retinale Ligand entscheidend für die Funktion des Rhodopsin-GPCR, und eine robuste und effiziente Versorgung mit 11-cis-Retinal muss kontinuierlich aufrechterhalten werden, um die hohe Umsatzrate innerhalb der Photorezeptoren zu überwinden.

Retinaldehyde wie 11-cis-Retinal gehören zu einer Gruppe von Molekülen, die zusammen als Retinoide bezeichnet werden, und biologisch relevante Retinoide werden allgemein als Vitamin A bezeichnet. Retinoide zeichnen sich durch eine zyklische Endgruppe aus, die mit einer konjugierten Polyenkette verbunden ist, mit einer polaren Endgruppe am anderen Ende. Retinaldehyde und assoziierte Vitamere des Vitamin A sind keine Ausnahme von dieser Charakterisierung, die den β-Ionon-Ring als cyclische Endgruppe, eine Diterpen-Polyen-Kette und eine je nach Vitamer unterschiedliche polare Endgruppe enthalten, d.h. Aldehydgruppe für Retinaldehyde, Hydroxylgruppe für Retinole, Carboxylgruppe für Retinsäuren, Esterbindung für Retinylester, usw. (Abbildung 1)9,10.

Säugetiere können Vitamin A nicht de novo synthetisieren, Pflanzen jedoch schon; Daher müssen alle Retinoide in Säugetiersystemen aus der Ernährung pflanzlicher Produzenten bis zu den Verbrauchern in der Nahrungskette stammen. Im kanonischen Modell des Vitamin-A-Stoffwechsels wird β-Carotin, das archetypische pflanzliche Provitamin A, über den Scavenger-Rezeptor der Klasse B, Mitglied 1 (SCARB1) in die Darm-Enterozyten aufgenommen, das durch β-Carotin-Oxygenase 1 (BCO1/BCMO1) in zwei Moleküle von all-trans-Retinal gespalten wird, das an das Retinaldehyd-bindende Protein 2 (RBP2) bindet und zu all-trans reduziert wird-Retinol durch Retinol-Dehydrogenasen (RDH), umgewandelt durch Lecithin-Retinol-Acyltransferase (LRAT) in Retinylester und dann in den Blutkreislauf in Chylomikron 11,12,13,14. Retinylester, wie z.B. Retinylpalmitat, dienen hingegen als vorherrschendes Provitamin A aus tierischen Quellen. Retinylpalmitat aus dem Darmlumen wird durch die Carboxylesterase 1 (CES1) zu all-trans-Retinol hydrolysiert und diffundiert in den intestinalen Enterozyten15. Die Leber ist das primäre Speicher- und homöostatische Organ für die Vitamin-A-Homöostase, die die Retinylester in diesen Chylomikronen absorbiert, die durch Retinylester-Hydrolasen zu all-trans-Retinol hydrolysiert werden, das an das zelluläre Retinol-bindende Protein 1 (CRBP1) gebunden ist, in hepatische Sternzellen eindringt und von LRAT zur Lagerung wieder in Retinylester umgewandeltwird 13,16, 17. Urheberrecht Um einen homöostatischen Vitamin-A-Spiegel im Organismus aufrechtzuerhalten, setzt die Leber Vitamin A in Form von all-trans-Retinol frei, das an einen Serumtransportkomplex gebunden ist, der aus dem Retinol-bindenden Protein 4 (RBP4) und Transthyretin (TTR) besteht15,18,19. Dieser Komplex wird in diesem Manuskript als Holo-RBP4 bezeichnet.

Um diese systemische Vitamin-A-Versorgung im Blut nutzen zu können, muss systemisches Gewebe, einschließlich des Augengewebes, in dem eine robuste Vitamin-A-Quelle aufrechterhalten wird, über eine Methode zur Aufnahme von Holo-RBP4 in das Gewebe verfügen. In der photorezeptorreichen Netzhaut im Augengewebe ist der durch Retinsäure 6 (STRA6) stimulierte Membranrezeptor der Transporter, der an dieser Funktion beteiligt ist. In mechanistischen Studien wurde gezeigt, dass STRA6 in der Lage ist, die Aufnahme von extrazellulärem all-trans-Retinol aus Holo-RBP4 in das RPE20 zu erleichtern. Dieses importierte all-trans-Retinol tritt dann in den visuellen Zyklus ein, d. h. in den Prozess, durch den all-trans-Retinol innerhalb des RPE und des äußeren Photorezeptorsegments in 11-cis-Retinal umgewandelt wird, wodurch die Sehfunktion erleichtert wird, wenn es an Rhodopsin 9,21 gebunden ist.

Sobald all-trans-Retinol aus zirkulatorischem Holo-RBP4 über STRA6 die Blut-Netzhaut-Schranke in das RPE im Augengewebe überquert, wird all-trans-Retinol im RPE zunächst durch LRAT zu Retinylester verestert und dann durch das retinale Pigmentepithel-spezifische 65-kDa-Protein (RPE65) zu 11-cis-Retinol hydrolysiert. 11-cis-Retinol wird dann durch die Retinol-Dehydrogenase 5 in 11-cis-Retinal umgewandelt. Dieses 11-cis-Retinal wird dann durch das Interphotorezeptor-Retinoid-bindende Protein (IRBP) in das äußere Segment (OS) des Photorezeptors transportiert9,21. Im endoplasmatischen Retikulum, das den Photorezeptorkern innerhalb der äußeren Kernschicht (ONL) umgibt, werden die Opsin-GPCRs synthetisiert und über das verbindende Zilium (CC) transportiert. Die Motorproteine, die an diesem Transport durch das CC beteiligt sind, sind umstritten, aber aktuelle Hypothesen implizieren, dass der Intraflagellentransport (IFT) von Kinesin und Dynein oder der Myosin-basierte Transport wahrscheinlich die Ursache für diesen Prozess sind 14,22,23,24,25,26. Sobald diese beiden Komponenten in den membranösen Scheiben innerhalb des OS aufeinandertreffen, bilden 11-cis-Retinal und Opsin 11-cis-Retinyliden durch eine kovalente Bindung der Schiff-Base an Lysin 196 auf Rhodopsin, bereit für die Phototransduktion8.

Während die Expression von STRA6 im RPE der Netzhaut die Aufnahme von all-trans-Retinol aus Holo-RBP4 erleichtert, wurde festgestellt, dass STRA6 in der Leber nicht exprimiert wird, obwohl es als primäres homöostatisches Organ für Vitamin A fungiert und Fähigkeiten bei der Aufnahme von all-trans-Retinol aus Holo-RBP4 aufweist 15,19,27,28, 29,30,31. Schließlich wurde ein analoger Rezeptor namens Retinol-bindender Protein-4-Rezeptor 2 (RBPR2) entdeckt, der die Fähigkeit zeigt, all-trans-Retinol aus Holo-RBP4 aufzunehmen, ähnlich wie STRA6, aber im Lebergewebe exprimiertwird 32.

Daher erfordert ein vollständiges Verständnis der Rolle von Rhodopsin für die Sehfunktion ein Verständnis der biologischen Prozesse, die in der Regeneration des Sehpigments gipfeln. Dies steht wiederum in engem Zusammenhang mit den zuvor beschriebenen Prozessen, einschließlich des Metabolismus von Provitamin-A-Vorläufern, der Speicherung in der Leber, der Freisetzung von Holo-RBP4 durch die Leber und der eventuellen Aufnahme von Holo-RBP4 durch STRA6- und RBPR2-Membranrezeptoren. Wie oben erwähnt, sind Tiermodelle wie Mäuse nach wie vor eines der führenden Modelle bei der Erforschung solcher Prozesse. Daher möchten wir eine Extraktionsmethode für Retinoide in murinem Gewebe vorstellen, sowie eine Normalphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)-Methode, mit der diese Retinoide nachgewiesen und quantifiziert werden können. Mit diesen Methoden können die oben beschriebenen wichtigen Retinoide, wie z.B. der 11-cis-retinale Rhodopsin-Ligand oder das Haupttransportretinoid all-trans-Retinol, in okulären, hepatischen und systemischen Organen analysiert werden. Durch die Bewertung der Retinoidversorgung in murinem Gewebe kann unser Verständnis der Krankheitszustände und Pathologien im Zusammenhang mit der logistischen Versorgung mit Retinoiden weiter verbessert werden.

Neben ihrer Funktion als Chromophor in der visuellen Funktion durch Assoziation mit Opsin-GPCRs spielen Retinoide auch eine wichtige Rolle bei der Signalübertragung von Säugetierzellen durch Retinsäure-Signalwege, die durch zwei Familien von Kernrezeptoren erleichtert werden, Retinsäurerezeptoren (RARs) und Retinoid-X-Rezeptoren (RXRs), die direkt an die DNA binden und die Gentranskription regulieren33. Diese beiden Familien oder Rezeptoren verwenden beide Retinoide in Form von Retinsäuren als Liganden. Es wurde gezeigt, dass RARs eine Affinität sowohl für all-trans-Retinsäure als auch für 9-cis-Retinsäure aufweisen, während RXRs eine Affinität für nur 9-cis-Retinsäure aufweisen34,35. Retinsäuren in unkontrollierten Mengen sind teratogen, und die Retinsäure-Signalübertragung muss extrem streng kontrolliert werden36. Die Produktion von Retinsäuren für die Signalübertragung muss lokal und zu sehr spezifischen Zeitpunkten erfolgen, um die richtige Entwicklung von Geweben zu gewährleisten, wie z. B. bei der Entwicklung des Hinterhirns und der Gliedmaßen, aber unzählige andere Beispiele nutzen die Retinsäure-Signalgebung37,38. In Zellen, die an der Retinsäure-Signalübertragung beteiligt sind, werden Retinsäuren durch zwei Gruppen von Enzymen synthetisiert: Alkohol/Retinol-Dehydrogenasen (ADHs/RDHs), die die Oxidation von Retinolen, die von STRA6 oder RBPR2 aufgenommen werden, zu Retinaldehyden erleichtern, und Retinaldehyd-Dehydrogenasen (RALDHs), die die Oxidation von Retinaldehyden zu Retinsäuren erleichtern39. Obwohl Retinsäuren nicht an der GPCR-Signalübertragung an sich beteiligt sind, stellen sie dennoch ein wichtiges Retinoid dar, das auch als Ligand für Signalrezeptoren fungiert.

Auch wenn hier nicht näher beschrieben, möchten wir die bisher etablierten Methoden zum Retinoid-Nachweis mittels HPLC in verschiedenen Kontexten, wie z.B. in der Lebensmittelforschung und der Erforschung von mikrobiellem Rhodopsin, würdigen. Diese Methoden verfolgen unterschiedliche Ziele und Ansätze für den Retinoid-Nachweis, einschließlich der Verwendung von Umkehrphasentechniken, die weniger flüchtige und gefährliche mobile Phasen erfordern 40,41,42, des Nachweises von Retinsäuren und ihrer zugehörigen Isomere40,41 sowie der Reinigung und Extraktion aus verschiedenen biologischen Quellen43. Unsere Methode konzentriert sich speziell auf den Nachweis von Retinylpalmitat, Retinaldehyd-Isomeren und Retinol-Isomeren aus Säugetiergewebe. Unterschiedliche Protokolle sollten in Betracht gezogen werden, wenn sich der vorgesehene Anwendungsfall von dieser speziellen Anwendung unterscheidet.

Protokoll

HINWEIS: Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Minnesota (Protokoll # 2312-41637A) genehmigt und in Übereinstimmung mit der ARVO-Erklärung für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung durchgeführt. Führen Sie alle Extraktionen im Dunkeln unter einem schwachen roten Licht zur Beleuchtung durch. Achten Sie auf das Restlicht, das von Instrumentendisplays und Zubehör-LEDs abgegeben wird.

1. Erzeugung von spektrophotometrischen Retinoid-Standards und externen Standardkurven

HINWEIS: Bereiten Sie vor der Analyse mit der HPLC einen Trockeneisbehälter für die vorübergehende Lagerung von Retinoiden vor.

  1. Wiegen Sie eine beliebige, aber angemessene Menge an Retinoiden und lösen Sie sie in einem geeigneten Lösungsmittel auf, um sie durch Spektrophotometrie zu quantifizieren.
    HINWEIS: Das in dieser Studie verwendete Lösungsmittel der Wahl ist Ethanol, und die molaren Absorptionswerte von in Ethanol gelösten Retinoiden sind in Tabelle 1 aufgeführt. Zum Auflösen von Standards und Proben muss wasserfreies Ethanol in HPLC-Qualität verwendet werden. Ethanol, das ausschließlich durch Destillation gereinigt wird, bildet ein azeotropes Gemisch mit Wasser, das etwa 4 Vol.-% Wasser enthält. Wasser ist nicht mischbar mit der hexanoischen mobilen Phase und führt zu einer Hydratation der stationären Phase der Kieselsäure, was schließlich zu einer Degradation der Säule führt.
  2. Unter Verwendung des Beer-Lambert-Gesetzes und des molaren Absorptionsvermögens des entsprechenden Retinoids wird die Konzentration des erzeugten Standards quantifiziert (Tabelle 1).
    Extinktion = molare Absorptionsfähigkeit (ε) × molare Konzentration × Weglänge
  3. Führen Sie serielle Verdünnungen durch, um Konzentrationen zu erzeugen, die eine Standardkurve innerhalb des Quantifizierungsbereichs für das gewünschte Gewebe erzeugen können.
    HINWEIS: Beachten Sie die grundlegenden Einschränkungen des Beer-Lambert-Gesetzes, wie z. B. seine mangelnde Gültigkeit bei hohen Konzentrationen von Analyt. Um dieses Problem zu vermeiden, sollten die verdünnten Retinoidstandards die Erzeugung von Absorptionswerten größer als 1 vermeiden. Für unsere Anwendungen in der Retinol- und Retinaldehyd-Quantifizierung in murinen Organen stellten wir fest, dass eine Kalibrierkurve mit einem Bereich von 1-10 ng in der Lage war, die typischen gefundenen Mengen abzudecken. Für die Quantifizierung von Retinylpalmitat aus der Leber von Mäusen fanden wir heraus, dass eine Kalibrierkurve mit einem Bereich von 20-80 μg in der Lage war, die typischen gefundenen Mengen abzudecken.
  4. Durch inkrementelle Änderung des Injektionsvolumens aus der zuvor erstellten Stammlösung, wodurch die injizierte Menge an Retinoid schrittweise verändert wird, integrieren Sie die Peaks, um eine externe Standardkurve zu erzeugen, die für die Retinoid-Quantifizierung geeignet ist, wobei die Peakintegration direkt proportional zur Menge des injizierten Retinoids ist.

2. Gewebeentnahme und Probenentnahme

HINWEIS: Bereiten Sie einen Trockeneisbehälter für die vorübergehende Lagerung von Gewebe vor der Gewebehomogenisierung und Retinoidextraktion vor. Die empfohlenen Mengen an Gewebeentnahme sind in Tabelle 2 aufgeführt. Um Retinoidschwankungen aufgrund von Schwankungen des Blutgehalts für jedes Gewebe zu berücksichtigen, sollte die Gewebeextraktion an vollständig durchbluteten Mäusen und die Blutextraktion an separaten Mäusen durchgeführt werden.

  1. Euthanasieren Sie die Mäuse gemäß den Richtlinien des vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) diktierten Protokolls (hier CO 2-Erstickung).
  2. Blut: Enthaupten Sie die Mäuse unmittelbar nach der Euthanasie mit einer Schere und lassen Sie das Blut aus dem Hauptrumpf der Mäuse in ein 1,5-ml-Röhrchen ab.
  3. Auge: Entferne mit einer Pinzette die Augen vom enthaupteten Kopf.
  4. Gehirn: Schneide mit einer kleinen Schere in den enthaupteten Kopf und entferne das Gehirn mit einer Pinzette.
  5. Niere, Leber, Milz, Herz und Lunge: Machen Sie mit einer kleinen Schere einen Schnitt in den Bauch, schneiden Sie in die obere Richtung entlang der Mittellinie und schneiden Sie durch das Brustbein und den Brustkorb. Entferne das freiliegende Gewebe mit einer Pinzette.

3. Homogenisierung des Gewebes

HINWEIS: Wenn die Analyse kleinerer Organpartitionen gewünscht wird, z. B. in größeren Organen (z. B. Leber- oder Lungengewebe), sollte das gesamte Organ homogenisiert werden, um Unterschiede im Retinoidgehalt in verschiedenen Teilen des Gewebes zu vermeiden. Partitionieren Sie stattdessen das Homogenat, wenn kleinere Gewebemengen gewünscht sind. Ein Schema für das Protokoll ist in Abbildung 2 dargestellt. Dieses modifizierte Protokoll wurde von Kane und Napoliübernommen 44.

  1. Legen Sie das Gewebe zusammen mit 50 % eiskalter Kochsalzlösung (0,9 %) und 50 % Methanol in das Gefäßmahlröhrchen. In Tabelle 2 finden Sie das für jeden Gewebetyp verwendete Volumen.
  2. Setzen Sie den Stößel in das Mahlrohr ein und führen Sie langsam und vorsichtig fünf volle Umdrehungen mit dem Stößel durch, um ein Homogenat zu erhalten.
  3. Füllen Sie die Proben unmittelbar nach der Homogenisierung in 15-ml-Röhrchen um.
  4. Fügen Sie 2 mL Methanol hinzu und lassen Sie es 15 Minuten bei Raumtemperatur ruhen.
    HINWEIS: Wenn eine Analyse von Retinaldehydoximderivaten gewünscht ist, fügen Sie 1 ml 0,1 M Hydroxylaminhydrochlorid in 0,1 M HEPES (pH 6,5) hinzu (Abbildung 1).

4. Retinoid-Extraktion

ACHTUNG: Hexan ist leicht entzündlich, leicht flüchtig und hochgiftig. Beim Umgang mit Hexan müssen vom National Institute for Occupational Safety and Health (NIOSH) zugelassene Atemschutzmasken, Augenschutz, Butylhandschuhe und ein Abzug verwendet werden. Beim Verdampfen von Hexan aus Proben wird eine Form von verstärkter Luftzirkulationsvorrichtung empfohlen, um die Bildung von Lösungsmitteldämpfen zu verhindern, z. B. eine Schnorchel-Saugvorrichtung.

  1. Geben Sie 10 mL Hexan zum Homogenat und mischen Sie das Röhrchen mindestens 10 s lang horizontal.
    HINWEIS: Es ist wichtig, dass sich die Phasen vollständig mischen.
  2. Das Homogenat/Hexan-Gemisch wird 3 Minuten lang bei 1.000 × g zentrifugiert, um die Phasentrennung zu erleichtern.
  3. Führen Sie die Extraktion 2x durch, um eine vollständige Extraktion der Retinoide aus dem Homogenat sicherzustellen. Wiederholen Sie die Schritte 4.1 und 4.2.
  4. Ziehen Sie die Hexanschicht mit einer Pipette ab und geben Sie die Hexanschicht zur Vakuumverdampfung in einen separaten Satz 15-ml-Glasröhrchen.
    HINWEIS: Verwenden Sie zum Verdampfen GLASS 15 ml-Röhrchen, um ein Anhaften von Retinoiden an den Wänden des Röhrchens zu vermeiden.
  5. Mit einer Vakuumzentrifuge das Hexan vollständig verdampfen.

5. Resuspensions- und HPLC-Analyse

HINWEIS: Da es sich bei dem in diesem Manuskript verwendeten HPLC-System um ein binäres Pumpensystem handelte, wurde die mobile Vierkomponenten-Phase vor der Operation in eine einzelne Flasche vorgemischt.

ACHTUNG: Alle vier organischen Lösungsmittel, die bei diesem Verfahren verwendet werden, sind leicht entzündlich, leicht flüchtig und hochgiftig. 1,4-Dioxan ist anfällig für die Bildung explosiver Peroxide, wenn es Sauerstoff ausgesetzt wird. Alle Gefäße, die 1,4-Dioxan enthalten, bei Nichtgebrauch geschlossen halten. Beim Umgang mit diesen Lösungsmitteln müssen vom National Institute for Occupational Safety and Health (NIOSH) zugelassene Atemschutzmasken, Augenschutz, Butylhandschuhe und ein Abzug verwendet werden. Während diese Lösungsmittel in einer HPLC betrieben werden, wird eine Form von verbesserter Luftzirkulation empfohlen, um die Ansammlung von Lösungsmitteldämpfen zu verhindern, z. B. ein Schnorchel-Sauggerät.

  1. Resuspendieren Sie das getrocknete 15-ml-Röhrchen mit 100 μl Hexan; Vortexen Sie gut, um sicherzustellen, dass alle Retinoide aufgelöst sind.
  2. Pipettieren Sie alle 100 μl Hexan in einen einzigen Glaseinsatz für die HPLC-Analyse.
  3. Aufbau des HPLC-Ablaufs (adaptiert von Landers und Olson45): mobile Phase: 85,4 % Hexan (v/v), 11,2 % Ethylacetat (v/v), 2 % Dioxan (v/v), 1,4 % 1-Octanol (v/v); Säule: zwei Säulen 4,6 mm ID x 250 nm, 5 μm, in Reihe geschaltet; ein mehrspaltiges Thermostat Temperatur: 25 °C; Injektionsvolumen: 100 μL; Durchflussrate: 1 mL/min; Laufzeit: 40 min. Verwenden Sie die Absorptionserkennung des UV-Spektrums; Lassen Sie die Option aktiviert, um ein UV-Spektrum von 200 nm bis 400 nm zu erfassen.

6. Peak-Identifizierung und -Integration

  1. Identifizieren Sie Peaks anhand der Retentionszeit und der UV-Spektren jedes Retinoids von Interesse, wie sie bei der Analyse von Retinoidstandards beobachtet wurden (Abbildung 3, Tabelle 3 und Tabelle 4).
  2. Unter Verwendung des chromatographischen Datensystems des gewählten HPLC-Systems werden die identifizierten Peaks integriert. Die Integration oder Fläche unter der Kurve ist direkt proportional zur Menge des Analyten. Referenzieren Sie die in Schritt 1 generierte externe Standardkurve, um den Analyten zu quantifizieren.
    1. Für die Analyse von Chromatogrammen, die aus biologischem Gewebe erzeugt werden, ist die manuelle Integration gegenüber der automatischen Integration zu verwenden, die von typischen chromatographischen Datensystemen angeboten wird, da bei solchen Proben häufig Variabilitäten bei Parametern wie der Retentionszeit beobachtet werden.
    2. Stellen Sie sicher, dass die Chromatogramme keine Unregelmäßigkeiten aufweisen, die auf Probleme während des Laufs hinweisen könnten, wie z. B. verrauschte Basislinien oder nicht-Gaußsche Peaks. Diese Probleme deuten auf Verunreinigungen in der HPLC oder Verschleiß an den Säulen hin und sollten für eine valide Analyse behoben werden.

Ergebnisse

Hier haben wir die oben beschriebene Methode zum Nachweis und zur Quantifizierung von Retinoiden in murinem okulärem und systemischem Gewebe verwendet und repräsentative Chromatogramme erstellt. Zusätzlich geben wir eine Zusammenfassung der typischen Retinoide, die in diesen Geweben nachgewiesen werden können.

Im Alter von 6 Monaten wurden die Mäuse durch CO2 -Erstickung eingeschläfert. Um den okulären Retinoidgehalt aufrechtzuerhalten, wurde...

Diskussion

Bei dieser Methode wird die Normalphasen-HPLC verwendet, um relevante Retinoide, einschließlich Retinylester, Retinaldehyde und Retinole, nachzuweisen und zu quantifizieren. Angesichts der Bedeutung von 11-cis-Retinal als kritischem Chromophor bei der Aktivierung des Rhodopsin-GPCR ist eine Methode, die die Metaboliten nachweisen kann, die mit der Produktion von 11-cis-Retinal in Verbindung stehen, entscheidend für die Untersuchung der gesamten Sehfunktion. Der Hauptv...

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch NIH-NEI-Zuschüsse (EY030889 und 3R01EY030889-03S1) und teilweise durch die Startkapitalhilfe der University of Minnesota für G.P.L. unterstützt. Wir möchten uns auch beim National Eye Institute für die Bereitstellung des in diesem Manuskript verwendeten 11-cis-Retinal-Standards bedanken.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent
1-Octanol, suitable for HPLC, ≥99.5%Sigma-Aldrich, Millipore Sigma203-917-6
1,4-Dioxane, suitable for HPLC, ≥99.5%Sigma-Aldrich, Millipore Sigma204-661-8
11-cis-retinalNational Eye InstituteN/A
11-cis-RetinolToronto Research ChemicalsTRC-R252105
13-cis-retinalToronto Research ChemicalsTRC-R239900
13-cis-retinolToronto Research ChemicalsTRC-R252110
All-trans-RetinalToronto Research ChemicalsTRC-R240000
All-trans-RetinolToronto Research ChemicalsTRC-R252002
Ethyl Acetate, suitable for HPLC, ≥99.7%Sigma-Aldrich, Millipore Sigma205-500-4
Hexane, HPLC GradeFisher Scientific, Spectrum Chemical18-610-808
Methanol (HPLC)Fisher ScienctificA452SK-4
Retinyl PalmitateToronto Research ChemicalsTRC-R275450
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)Fisher ScientificS271-500
Instruments
1260 Infinity II Analytical Fraction CollectorAgilentG1364F
1260 Infinity II Binary PumpAgilentG7112B
1260 Infinity II Diode Array DetectorAgilentG7115A
1260 Infinity II Multicolumn ThermostatAgilentG7116A
1260 Infinity II VialsamplerAgilentG7129A
ST40R Refrigerated CentrifugeThermo ScientificTSST40R
Vacufuge Plus Centrifuge ConcentratorEppendorf22820168
Consumables
2 mL Amber Screw Top VialsAgilent5188-6535
Crimp Cap with PTFE/red rubber septa, 11 mmAgilent5183-4498
Disposable Glass Conical Centrifuge TubesMillipore SigmaCLS9950215
Screw cap tube, 15 mLSarstedt62.554.502
Vial insert, 150 µL, glass with polymer feetAgilent5183-2088

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