Laserzellablation in intakten Drosophila-Larven zeigt synaptische Konkurrenz

Zusammenfassung

Dieses Protokoll demonstriert die Laserzellablation einzelner Neuronen in intakten Drosophila-Larven . Die Methode ermöglicht es, die Wirkung der Verringerung der Konkurrenz zwischen Neuronen im sich entwickelnden Nervensystem zu untersuchen.

Zusammenfassung

Das Protokoll beschreibt die Ablation einzelner Neuronen mit einem 2-Photonen-Lasersystem im Zentralnervensystem (ZNS) von intakten Larven von Drosophila melanogaster . Mit dieser nicht-invasiven Methode kann das sich entwickelnde Nervensystem zellspezifisch manipuliert werden. Die Störung der Entwicklung einzelner Neuronen in einem Netzwerk kann genutzt werden, um zu untersuchen, wie das Nervensystem den Verlust des synaptischen Inputs kompensieren kann. Einzelne Neuronen wurden im Riesenfasersystem von Drosophila spezifisch abgetragen, wobei der Schwerpunkt auf zwei Neuronen lag: der präsynaptischen Riesenfaser (GF) und dem postsynaptischen tergotrochanteralen Motoneuron (TTMn). Das GF synapsiert mit dem ipsilateralen TTMn, das für die Fluchtreaktion entscheidend ist. Die Ablation eines der GFs im 3^. Instar-Gehirn, kurz nachdem das GF mit dem axonalen Wachstum begonnen hat, entfernt die Zelle dauerhaft während der Entwicklung des ZNS. Das verbleibende GF reagiert mit dem fehlenden Nachbarn und bildet ein ektopisches synaptisches Terminal zum kontralateralen TTMn. Dieses atypische, bilateral symmetrische Terminal innerviert beide TTMns, wie durch Farbstoffkopplung nachgewiesen wird, und steuert beide Motoneuronen, wie elektrophysiologische Assays zeigen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ablation eines einzelnen Interneurons einen synaptischen Wettbewerb zwischen einem bilateralen Neuronenpaar zeigt, das den Verlust eines Neurons kompensieren und die normalen Reaktionen auf den Escape-Kreislauf wiederherstellen kann.

Einleitung

Die Laserablation ist ein bevorzugtes Werkzeug zum Sezieren neuronaler Schaltkreise in einer Vielzahl von Organismen. Es wurde in genetischen Modellsystemen wie Würmern und Fliegen entwickelt und im gesamten Tierreich eingesetzt, um die Struktur, Funktion und Entwicklung des Nervensystems zu untersuchen ^1,2,3. Hier wurde die Einzelneuronenablation eingesetzt, um zu untersuchen, wie Neuronen während des Schaltkreisaufbaus in Drosophila interagieren. Das Fluchtsystem der Fliege ist ein beliebter Schaltkreis für die Analyse, da es die größten Neuronen und die größten Sy....

Protokoll

Alle für das Protokoll verwendeten Tiere gehörten der Art Drosophila melanogaster an. Es gibt keine ethischen Probleme im Zusammenhang mit der Verwendung dieser Art. Eine ethische Freigabe war für die Durchführung dieser Arbeit nicht erforderlich. Die Einzelheiten zu den Drosophila-Arten , den Reagenzien und der Ausrüstung, die in der Studie verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Drosophila züchten und das richtige Larvenstadium auswählen

1. Wählen Sie eine Gal4-Treiberlinie, die die Expression in den Zellen steuert, die abgetragen werden sollen, und k....

Diskussion

Die Zellablation mit einem 2-Photonen-Mikroskop erwies sich als sehr erfolgreiche Methode, um die Entwicklung neuronaler Schaltkreise in Drosophila zu manipulieren. Da diese Methode nicht-invasiv ist, verursacht sie nur minimalen Schaden für das Tier. Die Daten unterstützen die Nützlichkeit dieser zellspezifischen Manipulation bekannter Schaltkreise.

Entscheidend für den Erfolg der Ablation war die Auswahl des am besten geeigneten Gal4-Treibers. Da das GFS gut untersucht ist, wurd.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jaxkson ImmunoResearch	111-545-003
Anti-green fluorescent protein, rabbit	Fisher Scientific	A11122	1:500 concentration
Apo LWD 25x/1.10W Objective	Nikon	MRD77220	water immersion long working distance
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	B4287-25G
Chameleon Ti:Sapphire Vision II Laser	Coherent
Cotton Ball	Genesee Scientific	51-101
Dextra, Tetramethylrhodamine, 10,000 MW, Lysine Fixable (fluoro-Ruby)	Fisher Scientific	D1817
Drosophila saline			recipe from Gu and O'Dowd, 2006
Ethyl Ether	Fisher Scientific	E134-1	Danger, Flammable liquid
Fly food B (Bloomington recipe)	LabExpress	7001-NV
Methyl salicylate	Fisher Scientific	O3695-500
Microcentrifuge tube 1.5 mL	Eppendorf	22363204
Microscope cover-slip 18x18 #1.5	Fisher Scientific	12-541A
Neurobiotin Tracer	Vector Laboratories	SP-1120
Nikon A1R multi-photon microscope	Nikon		on an upright FN1 microsope stand
NIS Elements Advanced Research	Nikon		Acquisition and data analysis software
Paraformaldehyde (PFA)	Fisher Scientific	T353-500
PBS (Phosphate Buffered Salin)	Fisher BioReagents	BP2944-100	Tablets
R91H05-Gal4	Bloomington Drosophila Stock Center	40594
shakB(lethal)-GAl4	Bloomington Drosophila Stock Center	51633
Superfrost microscope glass slide	Fisher Scientific	12-550-143
Triton X-100	Fisher Scientific	422355000	detergent solution
UAS-10xGFP	Bloomington Drosophila Stock Center	32185