Standardisierung einer neuartigen halbautomatischen Software zur Messung des Neuritenwachstums

Zusammenfassung

Neurit-Outgrowth-Assays liefern einen quantitativen Wert über regenerative neuronale Prozesse. Der Vorteil dieser halbautomatischen Software besteht darin, dass sie Zellkörper und Neuriten getrennt segmentiert, indem sie eine Maske erstellt und verschiedene Parameter wie Neuritenlänge, Anzahl der Verzweigungspunkte, Zell-Körper-Clusterfläche und Anzahl der Zellcluster misst.

Zusammenfassung

Effektive Live-Bildgebungsverfahren sind entscheidend, um die neuronale Morphologie zu beurteilen und das Wachstum von Neuriten in Echtzeit zu messen. Die korrekte Messung des Neuritenwachstums war im Laufe der Jahre eine langjährige Herausforderung im Bereich der neurowissenschaftlichen Forschung. Dieser Parameter dient als Eckpfeiler in zahlreichen in vitro Versuchsaufbauten, die von dissoziierten Kulturen über organotypische Kulturen bis hin zu Zelllinien reichen. Durch die Quantifizierung der Neuritenlänge kann festgestellt werden, ob eine bestimmte Behandlung funktioniert hat oder ob die axonale Regeneration in verschiedenen Versuchsgruppen verstärkt ist. In dieser Studie geht es darum, die Robustheit und Genauigkeit der Software zur Analyse des Neuritenwachstums von Incucyte Neurotrack zu demonstrieren. Diese halbautomatische Software ist in einem Zeitraffer-Mikroskopie-System erhältlich, das bei der Quantifizierung der Neuritenlänge in Phasenkontrastbildern mehrere Vorteile gegenüber den gängigen Methoden bietet. Der Algorithmus maskiert und quantifiziert mehrere Parameter in jedem Bild und gibt neuronale Zellmetriken zurück, einschließlich Neuritenlänge, Verzweigungspunkte, Zell-Körper-Cluster und Zell-Körper-Cluster-Flächen. Zunächst haben wir die Robustheit und Genauigkeit der Software validiert, indem wir ihre Werte mit denen des manuellen NeuronJ, einem Fiji-Plug-in, korreliert haben. Zweitens haben wir den Algorithmus verwendet, der sowohl mit Phasenkontrastbildern als auch mit immunzytochemischen Bildern arbeiten kann. Unter Verwendung spezifischer neuronaler Marker validierten wir die Machbarkeit der fluoreszenzbasierten Analyse des Neuritenwachstums an sensorischen Neuronen in vitro-Kulturen . Darüber hinaus kann diese Software die Länge von Neuriten über verschiedene Seeding-Bedingungen hinweg messen, die von einzelnen Zellen bis hin zu komplexen neuronalen Netzen reichen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Software eine innovative und zeitsparende Plattform für Neuriten-Outgrowth-Assays bietet und den Weg für schnellere und zuverlässigere Quantifizierungen ebnet.

Einleitung

Bei Ischiasnerven ist es möglich, die axonale Regeneration zu messen¹. Darüber hinaus haben In-vitro-Studien gezeigt, dass es machbar ist, das axonale Wachstum ^2,3 zu überwachen, um seine verschiedenen Phasen, von der axonalen Keimung bis zur axonalen Degeneration, sowohl in gesunden als auch in verletzten Neuronen zu verstehen. Durch die Verfolgung dieser Prozesse ist es möglich, Parameter wie axonale Polarität, Initiierung, Stabilität und Verzweigung zu messen. Der letzte Parameter ist entscheidend für das Verständnis der neuropathischen Schm....

Protokoll

1. Scannen des Behälters an der Maschine

HINWEIS: Die Erkennung erfolgt durch die eingebaute Basler Ace 1920-155 μm Kamera.

1. Öffnen Sie das Programm, indem Sie auf Mit Gerät verbinden klicken und Zeitplan - Erwerben auswählen. Klicken Sie dann auf das + -Zeichen.
2. Legen Sie fest, ob das Schiff wiederholt oder nur 1x gescannt werden soll, indem Sie die Option "Nach Zeitplan scannen " bzw. " Einmal jetzt scannen" auswählen.
3. Wählen Sie Neu aus, um ein brandneues Gef....

Diskussion

Die genaue Messung des Wachstums von Neuronen unter gesunden, verletzten und kranken Zuständen ist ein kritischer Parameter in vielen Versuchsanordnungen im Bereich der Neurowissenschaften. Unabhängig davon, ob es sich um organotypische Kulturen ganzer DRG-Explantate oder dissoziierter Kulturen handelt, war die korrekte Messung des axonalen Auswuchses in den letzten 20 Jahren eine große Herausforderung. Ohne eine zuverlässige und genaue Quantifizierung des Neuritenwachstums ist es un.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase A	Merck / Roche	10103586001
Dispase II (neutral protease, grade II)	Merck / Roche	4942078001
Dulbecco's modified eagle's medium	Merck / Sigma	D5796
Fetal bovin serum	Merck / Sigma	F7524
Ham's F-12 Nutrient Mix (1X)	ThermoFisher Scientific	21765029
Ham's F12 w/ L-Glutamine	Euroclone	ECM0135L
Hanks' Balanced Salt Solution	Euroclone	ECM0507L
HBSS (10X), no calcium, no magnesium, no phenol red	ThermoFisher Scientific	14185045
HyClone Characterized Fetal Bovine Serum (U.S.)	Cytiva	SH30071.03
Incucyte, Neurotrack Analysis Software	Sartorius	9600-0010
L-15 Medium (Leibovitz)	Millipore/Sigma	L5520
Laminin Mouse Protein, Natural	ThermoFisher Scientific	23017015
L-Cysteine	Merck / Sigma	C7352
Leibovitz's L-15 medium w/o L-glutamine	Euroclone	ECB0020L
mouse NGF 2.5S (>95%)	Alomone Labs	N-100
Neurobasal Medium [-] Glutamine	ThermoFisher Scientific	21103049
NSC-34	CELLutions Biosystems Inc (Ontario, Canada)	CLU140
Papain from papaya latex	Sigma	P4762
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15070063
Percoll (Density 1.130 g/mL)	Cytiva	17089101
Poly-D-Lysine Solution (1mg/mL)	EMD Millipore/Merck	A-003-E
Poly-L-Lysine Solution (0-01%)	Sigma	P4832
Recombinant Human NT-3	PeproTech	450-03
Retinoic Acid	Merck / Sigma	R2625
Trypsin-EDTA solution	Sigma	T3924
β-Tubulin III (Tuj1) antibody	Merck / Sigma	T8660