Zwei-Photonen-Laser-vermittelte Ablation von Osteoblasten in sich entwickelnden Zebrafischlarven

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen Zwei-Photonen-Laserablationsansatz, der an Zebrafischlarven durchgeführt wurde und als Modell dient, um die Knochenregeneration und die Auswirkungen der Immunantwort auf die Ablation zu untersuchen.

Zusammenfassung

Zebrafische (Danio rerio) haben eine hervorragende Fähigkeit, verschiedene Organe und Gliedmaßen zu regenerieren. Die Knochenregeneration im Zebrafisch wurde mit verschiedenen Methoden wie Flossenamputation, Schuppenrupfen, Schädeltrepanation und mikroskopischen Ansätzen untersucht. Unter Verwendung eines konfokalen Laserscanning-Aufbaus, der mit einem Zwei-Photonen-Laser ausgestattet ist, wurde eine Laserablationsmethode als Läsionsparadigma entwickelt, um knochenbildende Zellen (Osteoblasten) im sich entwickelnden Operkel von Zebrafischlarven abzutragen. Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht die präzise Ablation von Zellen, da Fläche, Form und Tiefe fein eingestellt werden können. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode die Bildgebung des Bereichs vor und kurz nach der Ablation, so dass kurzfristige Auswirkungen der Verletzung analysiert werden können. In diesem Versuchsaufbau wurde die Immunantwort nach Ablation von Osteoblasten im verletzten Bereich untersucht. Nach der Ablation wurde eine Zunahme der Rekrutierung von Makrophagen beobachtet, was auf die Relevanz ihres Vorhandenseins während der Knochenregeneration hinweist.

Einleitung

Zebrafische regenerieren verschiedene Organe wie Netzhaut, Gehirn, Herz und Bauchspeicheldrüse¹. Darüber hinaus regenerieren Zebrafische Skelettelemente, weshalb sie zur Untersuchung der Regeneration von Flossen, Schuppen und Schädelkappen verwendet wurden2^. Zur Untersuchung der Gewebe- und Knochenregeneration wurden verschiedene experimentelle Paradigmen verwendet, wie z. B. Flossenresektion (Amputation), Flossenfraktur, Schädeltrepanation ^3,4, Kryoverletzung ^5,6 oder genetische

Protokoll

Das Prüfprotokoll wurde von der Landesdirektion Sachsen genehmigt, Zulassungsnummern 25-5131/564/2, DD25-5131/450/4, 25-5131/496/56, DD25.1-5131/354/87. Die verwendeten Zebrafischstämme wurden gemäß den nationalen Rechtsvorschriften und unter standardisierten Bedingungen, wie bereits beschrieben, gehalten^27,28. Die Einzelheiten zu allen Reagenzien und der Ausrüstung, die in der Studie verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung von Materialien und Lösungen

1. Bewahren Sie die Emb....

Diskussion

Die Laserablation wird in verschiedenen Disziplinen der biologischen Forschung eingesetzt. Insbesondere war es nützlich als Methode zur Untersuchung der Geweberegeneration 10,11,12. Zum Beispiel wurden kürzlich die Rekrutierungs- und Phänotypveränderungen von angeborenen Immunzellen im Laufe der Zeit mit UV-Laser- oder Zwei-Photonen-Laserablationsassays analysiert, zusammen mit der Gewinnung.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Calcium chloride dihydrate, CaCl2·H2O	Carl Roth	5239.1
Cell Culture Dish, PS, 100/20 mm	Greiner Bio-one	664160
Dumont #55 Foceps	FST	11295-51	Tip shape straight, 11 cm, 0.05 x 0.02 mm
Falcon 6-well plate	Corning	353502
Glass-bottom microwell dish	MatTek	P35G-1.5-14-C	35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm Glass Diameter, Uncoated
Insight X3 multiphoton laser	Spectra-Physics
Leica Application Suite	LAS X, Leica Microsystems
Low melting agarose	Biozyme	840101	Biozym Plaque Agarose
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2O	Sigma-Aldrich	M5921
Mating cages			many varieties, e.g. Tecniplast
Methyleneblue	Carl Roth	A514.1
MS-222	SIGMA Aldrich	A5040
Potassium Chloride, KCl	PanReac AppliChem	131494
Sodium chloride, NaCl	Carl Roth	3957.1
SP8 FALCON	Leica Microsystems		Equipped with a Insight X3 multiphoton laser and Leica Application Suite software
Stainless Steel Dissect Needle	Bochem	12010	140 mm
Stereo Microscope System SZX16	Olympus		Equipped with a LED illumination base SZX2-ILLTQ
Thermostatic Cabinets TS - WTW	xylem	TS 608/2-i	For incubation (embryo)
Transfer pipette, 3.5 mL	SARSTEDT	861171	155 x 15 mm, LD-PE, transparent
Zeiss SteREO Discovery.V12 version 4.7.1.0.	Zeiss		Equipped with Axiocam MRm camera and AxioVision sofware