Larvale RNA-Interferenz in der Seidenraupe Bombyx mori durch Verabreichung von Chitosan/dsRNA-Nanopartikeln

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll für die Verabreichung von Chitosan/dsRNA-Nanopartikeln in Seidenraupenlarven der Bombyx mori vorgestellt, um Gen-Silencing durch Verschlucken zu induzieren.

Zusammenfassung

Die Seidenraupe, Bombyx mori, ist ein wichtiges Wirtschaftsinsekt mit einer jahrtausendealten Geschichte in China. Mittlerweile ist die Seidenraupe das Modellinsekt der Schmetterlinge mit einer guten Ansammlung von Grundlagenforschung. Es ist auch das erste Insekt bei Schmetterlingen, dessen vollständiges Genom sequenziert und zusammengesetzt wurde, was eine solide Grundlage für die Erforschung der Genfunktion bietet. Obwohl RNA-Interferenz (RNAi) in der reversen Genfunktionsforschung weit verbreitet ist, ist sie bei Seidenraupen und anderen Lepidopterenarten refraktär. Frühere erfolgreiche RNAi-bezogene Forschungen zur Verabreichung von doppelsträngiger RNA (dsRNA) wurden ausschließlich durch Injektion durchgeführt. Die Verabreichung von dsRNA durch Fütterung wird nie berichtet. In diesem Artikel beschreiben wir Schritt für Schritt Verfahren zur Herstellung der Chitosan/dsRNA-Nanopartikel, die durch Verschlucken an die Seidenraupenlarven verfüttert werden. Das Protokoll umfasst (i) die Auswahl des geeigneten Stadiums der Seidenraupenlarven, (ii) die Synthese von dsRNA, (iii) die Herstellung der Chitosan/dsRNA-Nanopartikel und (iv) die Fütterung der Seidenraupenlarven mit Chitosan/dsRNA-Nanopartikeln. Repräsentative Ergebnisse, einschließlich der Bestätigung des Gentranskripts und der Beobachtung des Phänotyps, werden vorgestellt. Die dsRNA-Fütterung ist eine einfache Technik für RNAi in Seidenraupenlarven. Da Seidenraupenlarven leicht zu züchten und groß genug sind, um sie zu betreiben, bietet sie ein gutes Modell zum Nachweis von RNAi von Larven bei Insekten. Darüber hinaus regt die Einfachheit dieser Technik die Beteiligung der Schüler an der Forschung an, was Seidenraupenlarven zu einem idealen genetischen System für den Einsatz im Klassenzimmer macht.

Einleitung

Die Seidenraupe, Bombyx mori, ist ein Insekt, das vor mehr als 5000 Jahren in China domestiziert wurde. Aufgrund ihrer Fähigkeit, Seide zu produzieren, ist die Seidenraupe ein wichtiges Nutzinsekt in der chinesischen Landwirtschaft und Seidenzucht. Die Seidenraupe steht nach der Fruchtfliege als Modellinsekt an zweiter Stelle. Als Modellinsekt bei den Schmetterlingen ist die Seidenraupe leicht zu züchten, mit einer großen Körpergröße und vielen Mutanten. Inzwischen ist die Seidenraupe das erste Lepidoptera-Insekt, dessen vollständiges Genom sequenziert wurde¹. Viele Datenbanken mit Informationen für Ge....

Protokoll

1. Seidenraupenarten und Aufzucht

1. Ziehen Sie mindestens 120 frisch geschlüpfte Seidenraupenlarven des 1^. Stadiums von B. mori P50 mit frischen Maulbeerblättern bei 25 ± 1 °C, photoperiodisch 12 h hell: 12 h dunkel und 75 % ± 5 % relativer Luftfeuchtigkeit auf.

2. Auswahl der Seidenraupenlarven

1. Wählen Sie Tag 1 der Larven des 5^. Stadiums für das RNAi-Experiment; Die Seidenraupenlarven wachsen nach Tag 3 des 5^. Stadiums schnell, was ideal ist, um die Unterschiede im Aussehen der Larven zu vergleichen.
   HINW....

Diskussion

Ein geeignetes Stadium ist wichtig für die Beobachtung des RNAi-Phänotyps, abhängig von den Zielgenen. Unsere vorläufigen Ergebnisse zeigten, dass Toll9-2 am Wachstum der Seidenraupe beteiligt ist. Die Größe und das Gewicht der Seidenraupenlarven nehmen im 5^. Stadium²¹ rapide zu. Daher werden die Larven des 5^. Stadiums als Bühne für das Fütterungsexperiment mit Chitosan/dsRNA-Nanopartikeln ausgewählt. Es ist auch möglich, .......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tube	Sangon	F601620	for dsRNA or nanoparticles reaction
10 μl pipette	Eppendorf	P13473G	to aspirate or resuspend liquid
100 μl pipette	Eppendorf	Q12115G	to aspirate or resuspend liquid
2.5 μl pipette	Eppendorf	P20777G	to aspirate or resuspend liquid
20 μl pipette	Eppendorf	H19229E	to aspirate or resuspend liquid
200 μl pipette	Eppendorf	H20588E	to aspirate or resuspend liquid
6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates	Costar	3516	for silkworm rearing individually
Acetic acid	Aladdin	A116165	to make TAE
Agarose M	BBI Life Sciences	A610013	for agarose gel electrophosis
Analytical balance	Sartorius	BSA224S	to weight ingredients
Centrifuge	Sartorius	Centrisart A-14C	to centrifuge to form dsRNA or nanoparticles
Chitosan	Sigma-Aldrich	C3646	to combine with dsRNA for preparation of nanoparticles
EDTA	Sangon	A500895	to make TAE
Ethanol	Aladdin	E130059	to make TAE, or for dsRNA precipitation
Freezer	Siemens	iQ300	to store dsRNA or nanoparticles
GoTaq Green Master Mix	Promega	M712	for PCR reaction
GoTaq qPCR Master Mix	Promega	A6002	for qRT-PCR reaction
Isopropanol	Aladdin	I112011	for dsRNA precipitation
NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	ThermoFisher	One	to determine the concentration of dsRNA
ph meter	Sartorius	PB-10	to prepare buffers
SanPrep Column PCR Product Purification Kit	Sangon	B518141	for PCR product purification
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889	to make 100 mM sodium acetate buffer
Sodium sulfate	Sigma-Aldrich	239313	to make 100 mM sodium sulfate buffer
T7 RiboMAX Express RNAi System	Promega	P1700	for dsRNA synthesis
ThermoMixer	Eppendorf	C	for dsRNA generation or nanoparticles heating
Tris	Sangon	A501492	to make TAE
Vortex	IKA	Vortex 3	to prepare chitosan/dsRNA nanoparticles