Einzelzell-Calcium-Imaging zur Untersuchung der Aktivierung von Calcium-Ionenkanälen

Zusammenfassung

In diesem Artikel wird eine Methode zur quantitativen Echtzeitüberwachung der Calciumionenkonzentration (Ca²⁺) in Zellen unter Verwendung von Einzelzell-Ca2⁺ -Bildgebung mit dem Fura-2/AM-Farbstoff vorgestellt. Diese Technik ermöglicht eine effiziente Farbstoffbeladung und eine genaue Berechnung des Ca2⁺ -Gehalts durch Fluoreszenzintensitätsverhältnisse, was sie zu einem einfachen und schnellen Ansatz für Forschungsanwendungen macht.

Zusammenfassung

Die Einzelzell-Ca2⁺ -Bildgebung ist essentiell für die Untersuchung von Ca2⁺ -Kanälen, die durch verschiedene Stimulationen wie Temperatur, Spannung, native Verbindung und Chemikalien usw. aktiviert werden. Es stützt sich in erster Linie auf die Mikroskopie-Bildgebungstechnologie und den verwandten Ca2⁺ -Indikator Fura-2/AM (AM ist die Abkürzung für Acetoxymethylester). In den Zellen wird Fura-2/AM durch Esterasen zu Fura-2 hydrolysiert, das reversibel an freies zytoplasmatisches Ca²⁺ binden kann. Die maximale Anregungswellenlänge verschiebt sich bei der Bindung von 380 nm auf 340 nm (bei Sättigung mit Ca²⁺). Die emittierte Fluoreszenzintensität hängt quantitativ mit der Konzentration des gebundenen Ca²⁺ zusammen. Durch die Messung des Verhältnisses 340/380 kann die^Ca2+ -Konzentration im Zytoplasma bestimmt werden, wodurch Fehler vermieden werden, die durch Schwankungen in der Ladeeffizienz der Fluoreszenzsonde zwischen verschiedenen Proben verursacht werden. Diese Technologie ermöglicht die quantitative und gleichzeitige Überwachung von Ca2⁺ -Veränderungen in mehreren Zellen in Echtzeit. Die Ergebnisse werden in ". XLSX"-Format für die anschließende Analyse, das schnell ist und intuitive Änderungskurven erzeugt, wodurch die Erkennungseffizienz erheblich verbessert wird. Aus verschiedenen experimentellen Perspektiven listet dieser Artikel den Einsatz dieser Technologie zum Nachweis von Ca2⁺ -Signalen in Zellen mit endogenen oder überexprimierten Kanalproteinen auf. Inzwischen wurden auch verschiedene Methoden zur Aktivierung von Zellen gezeigt und verglichen. Ziel ist es, den Lesern ein klareres Verständnis für die Verwendung und Anwendungen der Einzelzell-Ca2⁺ -Bildgebung zu vermitteln.

Einleitung

Ca²⁺ spielt eine entscheidende Rolle bei der zellulären Signaltransduktion und reguliert verschiedene zelluläre Funktionen wie Muskelkontraktion¹, Nervenleitung², Sekretion³ und Genexpression⁴ und beeinflusst dadurch mehrere physiologische Prozesse. Abnorme Ca2⁺ -Konzentrationen können zu Krankheiten wie Herzrhythmusstörungen⁵, Gerinnungsstörungen⁶ und hormonellen Ungleichgewichten⁷ führen. Daher ist die Untersuchung der Mechanismen intrazellulärer....

Protokoll

Die experimentellen Methoden wurden von den IACUC-Richtlinien der Tsinghua-Universität und der Peking-Universität für Chinesische Medizin genehmigt und befolgten diese. Dieses Protokoll führt einzellige Ca2⁺ -Bildgebungsverfahren für verschiedene Zelltypen ein, einschließlich primärer Keratinozyten, die aus der Haut mehrerer neugeborener Mäuse isoliert wurden (innerhalb von drei Tagen nach der Geburt, mit geschlechtsrandomisierten Wurfgeschwistern, C57BL/6-Mäuse). Einzelheiten zu den in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

Ergebnisse

Erkennung des Temperaturverhaltens
Primärer Keratinozyten
Primäre Keratinozyten wurden aus neugeborenen Mäusen isoliert und gemäß den etablierten Protokollen¹⁰ präpariert. Diese Zellen wurden in 24-Well-Platten mit Glasobjektträgern ausgesät. Nach dem Laden der Fura-2-Sonde wurde der Fokus unter dem Mikroskop bei einer Wellenlänge von 380 nm eingestellt, um eine klare Visualisierung der Zellmorphologie zu erreichen, wie in.......

Diskussion

Die Anwendung von Einzelzell-Ca2⁺-Bildgebungssystemen ist umfangreich und ermöglicht die Untersuchung von^Ca2+-Signalen in verschiedenen Zelltypen, einschließlich Keratinozyten, Stammzellen¹⁶, Leberzellen, Herzzellen¹⁷, Podozyten¹⁸, Immunzellen und Zelllinien, die Zielproteine überexprimieren^10,19. Diese Technik misst Änderungen und a.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Camera	Nikon
Capsaicine	Sigma	211275
CL-100 temperature controller	Warner Instruments
Cyclopiazonic Acid (CPA)	Sigma	C1530
DG-4 light	Sutter Instrument Company
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Amresco	231
DPBS	Thermofisher	14190144
Fluorescence imaging software (MetaFluor, Paid software)	Molecular Devices
Fluorescence microscope	Nikon
Fura-2/AM	Invitrogen	F1201
HBSS buffer	Gibco	14175103
HEPES	Sigma	H3375
Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000008
Pluronic F-127	Beyotime	ST501
poly-D-lysine	Beyotime	ST508
SC-20 liquid circulation heating/cooling device	Harvard Apparatus
White-light source	Nikon