Erzeugung von Sphäroiden aus verschiedenen Chondrozyten unter Verwendung von niedrigadhäsiven Bedingungen unter Schwerkraft und selbstgemachten Mini-Bioreaktoren

Zusammenfassung

Diese Studie beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von chondrozytären Sphäroiden, indem Zellen unter Verwendung der Schwerkraft unter Bedingungen mit geringer Adhäsion zu Sphäroiden aggregiert werden, gefolgt von der Kultivierung der resultierenden Sphäroide in Mini-Bioreaktoren.

Zusammenfassung

Die Knorpelreparatur bei chronischen Gelenkerkrankungen erfordert fortschrittliche zellbasierte Therapien, um geschädigtes Gewebe effektiv zu regenerieren. Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Methode zur Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) in Chondrozyten-basierte Sphäroide und unterstützt so Tissue Engineering und Zelltherapieanwendungen. Der Differenzierungsprozess ist sorgfältig strukturiert, um die Bindung an die chondrogene Abstammungslinie zu fördern, beginnend mit iPSCs, die in spezifischen Medien kultiviert werden und die Zellen nacheinander durch kritische Stadien der Differenzierung führen. Zunächst werden iPS-Zellen expandiert, um eine optimale Konfluenz zu erreichen, bevor sie unter Verwendung einer Reihe definierter Medienänderungen in Richtung chondrogener Linie induziert werden. Bis zum 10. Tag werden die Zellen auf ein Chondrogenese-förderndes Medium umgestellt, das die Bildung von Chondrozyten-ähnlichen Zellen fördert, die Schlüsselmarker reifer Chondrozyten exprimieren. Eine weitere Aggregation in 96-Well-Agarose-beschichteten Platten führt zur Bildung dreidimensionaler Sphäroide, die dann in speziellen Mini-Bioreaktoren kultiviert werden, die eine Mikroumgebung simulieren sollen, die die Ablagerung extrazellulärer Matrix (ECM) fördert. Durch die skalierbare Produktion von Chondrozyten-Sphäroiden, die native Knorpeleigenschaften nachahmen, bietet dieser Ansatz eine vielversprechende, reproduzierbare Lösung für die Entwicklung zellbasierter Behandlungen für Knorpeldefekte und bietet einen breiten Nutzen für klinische und Forschungsanwendungen in der muskuloskelettalen regenerativen Medizin.

Einleitung

Die Prävalenz von Gelenkerkrankungen führt aufgrund der steigenden Zahl behinderter Patienten und der damit verbundenen Kosten zu erheblichen wirtschaftlichen Belastungen. Hyaliner Knorpel ist ein bindegliedriges avaskuläres Gewebe mit begrenztem regenerativem Potenzial¹. Die längere Einnahme bestimmter nichtsteroidaler Antirheumatika (NSAIDs), Glukokortikoide und Chemotherapie oder Strahlentherapie kann die Regenerationsfähigkeit des Knorpels weiter verringern und seine Heilungsfähigkeit fast eliminieren². Dies macht es schwierig, autologe Knorpelzellen für die Zelltherapie zu gewinnen.....

Protokoll

Die Studie wurde von der Ethikkommission des LOPUKHIN FRCC PCM geprüft und genehmigt (Protokoll Nr. 2019/02 vom 9. April 2019). Alle Spenderproben wurden in Übereinstimmung mit den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki entnommen. Die Einverständniserklärung wurde von allen Teilnehmern und/oder ihren Erziehungsberechtigten eingeholt.

HINWEIS: Behalten Sie während des gesamten Protokolls die sterile Technik bei. Erwärmen Sie alle Nährmedien und -lösungen auf 37 °C, bevor Sie sie auf Zellen oder Sphäroide auftragen. Kultivieren Sie die Zellen in einem CO₂ -Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO₂

Ergebnisse

Das skizzierte Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. Bei dieser Methodik werden zwei unterschiedliche Nährmedien verwendet, um die Differenzierung von iPSCs in Chondrozyten-Sphäroide über einen Zeitraum von mindestens 1 Monat voranzutreiben (Abbildung 2). Der Differenzierungsprozess wird eingeleitet, wenn iPSCs eine Konfluenz von 75 % bis 90 % erreichen (Abbildung 1B

Diskussion

iPSCs stellen ein transformatives Werkzeug in der regenerativen Medizin dar und bieten das Potenzial, patientenspezifische Chondrozyten für die Knorpelreparatur zu generieren. Aktuelle Protokolle nutzen die gerichtete Differenzierung über mesodermale Signalwege, wobei Schlüsselsignalmoleküle wie TGF-β und BMP-2 die Bindung an die chondrozytäre Linie fördern. Diese Methoden zielen darauf ab, die embryonale Knorpelentwicklung zu replizieren und die Produktion von extrazellulären Ma.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin solution	Thermo Fisher Scientific	25300-062
0.25% Trypsin solution	Thermo Fisher Scientific	25200-072
Advanced DMEM/F12 Eagle's medium	Thermo Fisher Scientific	12634028
Aggrecan Monoclonal Antibody	Invitrogen	AHP0022	Host: Mouse; Dilution: 1/500
Ascorbic acid	Sigma	A4544	50 μg/mL
B-27 supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044	1x or 2%
Beta-mercaptoethanol	Serva	28625	90 mM
BMP2	Miltenyi biotec	130-110-922	10 ng/mL
Chir 99021	Miltenyi biotec	130-103-926	10 μM
COL1A1 (E6A8E) Monoclonal antibody	CellSignalling	39952	Host: Rabbit; Dilution: 1/800
COL2A1 (M2139) Monoclonal antibody	Santa Cruz	sc-52658	Host: Mouse; Dilution: 1/50
Collagenase type II solution	PanEco	P011-2	0.01%
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)	Sigma-Aldrich	D9542-5MG	1 μg/mL
DMEM medium w/o glutamine	PanEco	С420п
Fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	10270106	10%
Hanks' solution	PanEco	Р020п
Hybris 8 medium	PanEco	С780Е/Ф780
Insulin-Transferrin-Selenium solution	PanEco	Ф065	1x solution has the following concentrations: Insulin: 10 µg/mL; Transferrin: 5.5 µg/mL; Selenium 5 ng/mL
L-alanyl-L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	35050038	2 mM
Matrigel Matrix	BD	354277	300 μg/mL
Penicillin-Streptomycin solution	PanEco	А063п	100 U/mL
Retinoic acid	Miltenyi biotec	130-117-339	10 nM
Rho kinase inhibitor Y27632	Miltenyi biotec	130-103-922	10 mM
Secondary Antibody Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed, Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A21422	Host: Goat; Dilution: 1/500
Secondary Antibody Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed, Alexa Fluor Plus 555	Thermo Fisher Scientific	А32732	Host: Goat; Dilution: 1/500
Sox9 (D8G8H) Monoclonal antibody	CellSignalling	82630	Host: Rb; Dilution: 1/400
TeSR-1 medium	STEMCELL technologies	85850
TGF-β1	Miltenyi biotec	130-095-067	10 ng/mL