Bereiten Sie die ORO-Lösung vor, indem Sie 0,5 Gramm ORO-Pulver in 100 Milliliter Isopropanol auflösen, um eine Stammlösung zu erzeugen. Bereiten Sie die Arbeitslösung für alle Muskeln vor, indem Sie die ORO-Stammlösung und deionisiertes Wasser in einem Verhältnis von 60 zu 40 kombinieren. Decken Sie die Arbeitslösung 10 Minuten lang ab, damit sich die Partikel absetzen können.
Filtern Sie es durch ein 40-Mikrometer-Netz, gefolgt von einem 0,22-Mikrometer-Spritzenfilter. Als nächstes entfernen Sie die Formaldehydlösung von den dezellularisierten Muskeln in der Well-Platte und waschen die Muskeln dreimal mit einem gleichen Volumen PBS. Ersetzen Sie dann das PBS durch ein gleiches Volumen von 60%iger Isopropanollösung und inkubieren Sie es fünf Minuten lang auf dem Schaukelschüttler.
Wenn Sie fertig sind, ersetzen Sie die 60%ige Isopropanollösung vor 10 Minuten Inkubation auf dem Schaukelschüttler durch eine ORO-Arbeitslösung. Ersetzen Sie als Nächstes die ORO-Arbeitslösung durch ein gleiches Volumen von 1 % SDS und überprüfen Sie die SDB-Lösung regelmäßig. Sobald die Lösung merklich rosa wird, ersetzen Sie die SDS-Lösung durch eine frische 1%SDS-Lösung.
Wenn die Lösung 24 Stunden lang klar bleibt, ersetzen Sie das 1%SDS durch PBS. Entfernen Sie unter einem Stereomikroskop mit vierfacher Vergrößerung alle offensichtlichen Ablagerungen oder Partikel, die an der Außenseite des gefärbten Muskels haften. Wenn die Färbung zufriedenstellend ist und die leuchtend roten Kugeln in einer transparenten Matrix schweben, nehmen Sie die Färbebilder mit einer am Stereomikroskop befestigten Kamera auf.
Richtig dezellularisierte Muskeln waren weiß und halbtransparent. Wenn dezellularisierte Muskeln mit ORO gefärbt wurden, um intramuskuläres Fettgewebe (IMAT) sichtbar zu machen, waren IMAT-Lipidtröpfchen in den klaren Muskelstrukturen als rote Kugeln sichtbar. Gesunde Muskeln der hinteren Gliedmaßen von Mäusen zeigten ein wenig natürliches IMAT, das sich durch wenig bis gar kein rotes oder positives Lipid im Vergleich zu den Muskeln der hinteren Gliedmaßen zeigte, denen Herz-Kreislauf-Toxin oder Glycerin injiziert wurde.
Eine unvollständige Dezellularisierung wurde unmittelbar nach der initialen SDS-Behandlung oder nach dem Auswaschen der ORO-Färbung als semi-opake hellrosa Fasern identifiziert. Eine unvollständige ORO-Clearance wurde nach der ORO-Auswaschung als rosa oder roter einheitlicher Hintergrund und nicht als ausgeprägte Faserlinien identifiziert.
