Um mit der Quantifizierung der gefärbten IMAT-Lipidtröpfchenmetriken zu beginnen, öffnen Sie Konfokale Stapel in ImageJ. Öffnen Sie die Schwellenwert-Benutzeroberfläche, indem Sie "Bild", dann "Anpassen" und dann "Schwellenwert" auswählen. Wählen Sie in der Benutzeroberfläche Intermodes als Schwellenwerttyp aus, und stellen Sie sicher, dass Dunkler Hintergrund ausgewählt ist.
Klicken Sie dann auf Anwenden, um einen Schwellenwertalgorithmus auszuführen. Führen Sie den Wassereinzugsgebietsalgorithmus aus, um sich berührende Lipidtröpfchen zu trennen, indem Sie "Verarbeiten", dann "Binär" und "Wassereinzugsgebiet" auswählen. Wählen Sie in einem Dialogfeld Ja aus, um alle Bilder im Stapel zu verarbeiten und eine dünne schwarze Linie hinzuzufügen, die größere Bereiche mit einfarbigem Weiß teilt.
Um die maximale und minimale Partikelgröße festzulegen, öffnen Sie das Originalbild und umreißen Sie das kleinste und größte Lipidtröpfchen in der Ansicht mit dem ovalen Werkzeug. Fügen Sie diese Formen dann dem ROI-Manager hinzu, indem Sie T eingeben. Wählen Sie "Analysieren" und dann "Messungen festlegen" aus. Wählen Sie im Dialogfeld die Einstellungen aus, aktivieren Sie Nur Bereich, und klicken Sie auf OK. Wählen Sie dann im ROI-Manager die Option Messen aus.
Verwenden Sie die beiden Flächenkennzahlen aus diesem Ergebnisfenster als Größenbereich, und analysieren Sie Partikel. So identifizieren Sie die Region of Interest (ROIs) mit dem Algorithmus zur Analyse von Partikeln. Wählen Sie "Analysieren" und dann "Partikel analysieren" aus.
Es öffnet sich ein Dialogfenster, in dem Sie die Auswahleinstellungen festlegen können. Um die ROI-Messungen auszugeben, wählen Sie "Analysieren", dann "Messungen festlegen" und wählen Sie "Fläche", "Schwerpunkt", "Ellipse anpassen" und "Stapelposition" aus. Klicken Sie auf OK. Wählen Sie dann im ROI-Manager die Option Messen aus.
Die Daten in der Ergebnistabelle können ausgewählt und zur weiteren Analyse in Excel kopiert werden. Für eine detaillierte Beurteilung der individuellen Lipidtröpfchenmetrik und -verteilung wurden die BODIPY-fluoreszenzmarkierten Lipidtröpfchen mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet. Die Schwellen- und Formsegmentierung lieferte einen guten ersten Durchgang, um ROIs für jedes Lipidtröpfchen zu generieren.
Es waren jedoch manuelle Bearbeitungen erforderlich, um die Fehler zu beheben. Tiefe Lipidtröpfchen, die auf dem Bild schwach erschienen, können von Hand mit dem Oval-Werkzeug in ImageJ hinzugefügt werden. Eine Gruppe von Lipidtröpfchen, die fälschlicherweise als ein einzelner ROI identifiziert wurden, kann auch korrigiert werden, indem der ursprüngliche ROI gelöscht und durch mehrere neue ROIs ersetzt wird.
Wenn ein einzelnes Lipidtröpfchen in mehreren Schichten als eindeutiger ROI identifiziert wurde, wurden die doppelten ROIs zu einem einzigen ROI konsolidiert.
