Behandeln Sie die Passage von zwei AdMSCs mit Medien, die 10 Nanogramm pro Milliliter TNF alpha enthalten, für 24 Stunden oder ohne TNF alpha für nicht stimulierte Zellen. Nachdem Sie die Zellen vier Stunden lang gewaschen und in serumfreien Medien inkubiert haben, fügen Sie jedem Einsatz 25.000 AdMSCs hinzu und inkubieren Sie sie 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Saugen Sie den Inhalt beider Vertiefungen an und setzen Sie sie ein, waschen Sie sie dann zweimal mit PBS, wobei jeweils ein Milliliter PBS verbleibt.
Entfernen Sie die Einsätze mit einer Pinzette nacheinander und wischen Sie die obere Kammer vorsichtig, aber gründlich mit einem Wattestäbchen ab, um nicht migrierte Zellen zu entfernen. Saugen Sie das restliche PBS an und pipettieren Sie 500 Mikroliter kristallviolette Lösung in die Vertiefung und die obere Kammer des Einsatzes. Die kristallviolette Lösung wird nach einer Stunde Inkubation aus der Vertiefung und der oberen Kammer des Einsatzes abgesaugt.
Legen Sie den Einsatz nach dem Waschen und Abwischen der oberen Kammer in eine neue 24-Well-Platte mit einem Milliliter PBS. Bilden Sie mit einem inversen Mikroskop mit einer Kamera vier zufällige Bereiche in Richtung der Mitte des Einsatzes unter einem 10-fachen Objektiv ab. Laden Sie die Bilder in die bevorzugte Bildverarbeitungssoftware hoch und passen Sie den Hintergrund an, um den Kontrast mit violett gefärbten Zellen zu verbessern.
CLIA, die mit 22L infiziert waren, zeigten eine erhöhte mRNA-Expression für die Entzündungsmarker CCL2, CCL5 und IL1 beta und den Astrozytenmarker S100 beta im Vergleich zu denen, die mit NBH behandelt wurden. Die Kokulturierung mit AdMSCs verringerte die Expression der inflammatorischen Zytokine CCL2, CCL5 und IL1 beta, aber nicht TNF alpha sowohl für MBH- als auch für 22L-infizierte Zellen. BV2s, die mit AdMSCs kokultiviert wurden, zeigten eine Abnahme der mRNA für die Entzündungsmarker IL1 beta, IL-6, TNF alpha und das Komplementprotein C1qa sowohl in NBH- als auch in RML-behandelten Zellen.
Darüber hinaus verringerten AdMSCs das M1-Mikroglia-Gen CD16 und erhöhten den M2-Mikroglia-Marker ARG-1. Der In-vitro-Migrationstest deutete darauf hin, dass AdMSCs eine signifikante Migration in Richtung Medien mit 1 % RML zeigten.
