Nehmen Sie zunächst den aufgetauten digitalen Tröpfchen- oder ddPCR-Mastermix und fügen Sie Sonden, Vorwärtsprimer und Rückwärtsprimer bei Raumtemperatur hinzu. Bereiten Sie die Mastermischung für jedes Amplifikationsziel gemäß der vorgeschlagenen Zusammensetzung vor, die auf dem Bildschirm angezeigt wird, und passen Sie die Konzentrationen von Primern und Sonden nach Bedarf an. Das Gemisch gründlich vortexen und in einer Minizentrifuge kurz zentrifugieren.
Fügen Sie das Restriktionsenzym hinzu und drehen Sie es um, um es zu mischen. Als nächstes geben Sie 16,5 Mikroliter des vorbereiteten Mastermixes in jede Vertiefung einer PCR-Platte und versiegeln die Platte mit einer transparenten Klebefolie. Verwenden Sie den Probenverdünnungspuffer als Verdünnungsmittel, bereiten Sie die Qualitätskontrolle oder die QC-Verdünnungen vor, wie in dieser Tabelle beschrieben, die die empfohlenen Konzentrationen für eine Validierungsgenauigkeit und einen Präzisionslauf darstellt.
Verdünnen Sie die Tränenproben mit einem Probenverdünnungspuffer im Verhältnis 1:10 in 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen und verschließen Sie die Röhrchen. Erhitzen Sie die Proben in einem Thermocycler 10 Minuten lang bei 95 Grad Celsius und anschließend mindestens 5 Minuten bei 4 Grad Celsius. Entfernen Sie den Klebefilm von der ddPCR-Platte, die die Mastermischung enthält, und geben Sie 5,5 Mikroliter QC-Verdünnung in die entsprechenden Vertiefungen der 96-Well-Platte, wie in der Plattenkarte gezeigt.
Geben Sie dann 5,5 Mikroliter Probe in die Vertiefungen. Fügen Sie 5,5 Mikroliter Probenverdünnungspuffer zu den NTC-Vertiefungen ohne Template-Kontrolle hinzu. Verdünnen Sie 2x ddPCR-Pufferkontrolle im Verhältnis 1:2 mit nukleasefreiem Wasser und geben Sie 22 Mikroliter des Puffers in leere Vertiefungen einer Säule.
Fügen Sie der Platte eine durchstechbare Foliendichtung hinzu und legen Sie die Platte in die Plattenversiegelung. Versiegeln Sie die Platte 5 Sekunden lang bei 180 Grad Celsius. Wirbeln Sie die Platte mindestens 30 Sekunden lang mit maximaler Drehzahl und zentrifugieren Sie sie kurz in einem Plattenschleuderer.
Wählen Sie auf dem Touchscreen des automatischen Tröpfchengenerators die Spalten auf der Plattenkarte aus, die die Proben enthalten. Das Deck des Instruments leuchtet auf, um anzuzeigen, welche Verbrauchsmaterialien benötigt werden. Laden Sie den Tröpfchengenerator von hinten nach vorne.
Das gelbe Licht wechselt von gelb zu grün, um anzuzeigen, dass die Verbrauchsmaterialien ausreichend sind. Platzieren Sie einen Kühlblock und den Tropfenplattenhalter. Stellen Sie sicher, dass der Block vollständig blau gefärbt ist und kein Rosa sichtbar ist.
Legen Sie eine neue ddPCR-Platte mit 96 Schweißnähten in den kalten Block. Legen Sie die vorbereitete PCR-Platte in den Probenplattenhalter. Schließen Sie den Maschinendeckel und drücken Sie Start, um Tröpfchen zu erzeugen.
Entfernen Sie innerhalb von 30 Minuten die Platte mit den Tröpfchen aus dem kalten Block. Fügen Sie der Platte eine durchstechbare Foliendichtung hinzu und legen Sie die Platte in die Plattenversiegelung. Verschließen Sie es fünf Sekunden lang bei 180 Grad Celsius.
Legen Sie dann die Platte in einen kompatiblen Thermocycler und geben Sie die auf dem Bildschirm angezeigten Zyklusbedingungen ein. Legen Sie die Platte in das Tröpfchenlesegerät ein und achten Sie darauf, dass genügend Leseöl verbleibt und der Abfallbehälter ausreichend Platz hat. Drücken Sie abschließend die Lesetaste in der Software, um mit dem Lesen der Tröpfchen zu beginnen.
Für jede Konzentration in jedem Assay wurde ein Intra-Assay-Mittelwert berechnet, der zur Beurteilung der Präzision und Genauigkeit des Assays verwendet wurde. Eine mittlere Inter-Assay-Präzision von 7,7 % und eine mittlere absolute Inter-Assay-Genauigkeit von 4,2 % wurden über alle QC-Stufen hinweg gefunden. Die Genauigkeit und Präzision zwischen den Proben wurde ebenfalls anhand des Inter-Assay-Mittelwerts jeder QC-Stufe innerhalb jeder Charge berechnet.
Es wurde eine Inter-Assay-Präzision von 4 bis 8,5 % und eine absolute Inter-Assay-Genauigkeit von eins bis 3,2 % gefunden. In ähnlicher Weise wurde für die Tränenprobe eine mittlere Inter-Assay-Präzision von 3,7 % auf der hohen Spike-Ebene und 12,2 % auf der niedrigen Spike-Ebene sowie eine mittlere absolute Genauigkeit zwischen den Assays von 11,3 % auf der hohen Ebene und 8,1 % auf der niedrigen Ebene beobachtet. Bei der Inter-Assay-Berechnung wurde eine Präzision von 5,5 % auf hohem und 7,1 % auf niedrigem Niveau sowie eine absolute Genauigkeit von 11,3 % auf hohem und 8,1 % auf niedrigem Niveau gefunden.
