Zu Beginn wird ein eingefrorener Vorrat an SH-SY5Y-Zellen in FBS schnell aufgetaut. Mit 10% DMSO angereichert und mit vorgewärmtem Medium zehnfach verdünnt. Zentrifugieren Sie dann die Zellen und entfernen Sie den Überstand.
Resuspendieren Sie das Zellpellet in fünf Milliliter vorgewärmtem Medium und die Samenzellen in einem T25-Kolben. Zur Herstellung von Deckgläsern, die mit PDL beschichtet sind, tragen Sie 600 Mikroliter 50 Mikrogramm pro Milliliter PDL-Lösung auf jede Vertiefung steriler Deckgläser auf. Das Volumen der PDL, die jedem Well hinzugefügt wird, variiert je nach Größe des Wells.
Inkubieren Sie die Deckgläser bei Raumtemperatur für eine Stunde. Nach der Inkubation die PDL-Lösung entfernen und das Deckglas dreimal mit 1,8 Milliliter destilliertem Wasser abspülen. Lassen Sie die beschichtete Kammer zwei Stunden lang an der Luft trocknen.
Sobald die SH-SY5Y-Zellen eine Konfluenz von 80 bis 90 % erreicht haben, dissoziieren Sie sie durch Zugabe von Trypsinlösung. Neutralisieren Sie das Trypsin durch Zugabe eines vorgewärmten DMEM-Mediums. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension und suspendieren Sie das Pellet erneut in DMEM.
Zählen Sie die Zellen auf einem automatischen Zellzähler. Als nächstes säen Sie die Zellen mit einer Dichte von 1,5 mal 10 bis zur vierten Zelle pro Quadratzentimeter auf das PDL-beschichtete Kammerdeckglas. Ersetzen Sie das Medium am ersten und dritten Tag durch DMEM, das entweder mit fünf bzw. 2 % FBS, 1 % antibiotischem Antimykotikum und entweder 10 mikromolaren RA oder 95 % Ethanol desselben Additivvolumens ergänzt ist, um als Vehikelkontrolle für die Differenzierung zu dienen.
Bereiten Sie einen PKMO-Vorrat aus vorgewärmtem Phenylrot-freiem DMEM vor, der je nach Differenzierungszustand mit zwei oder 10 % FBS, 1 % Antibiotikum, Antimykotikum und 20 Millimolar ergänzt wird. Am sechsten Tag spülen Sie die Zellen zweimal mit bildgebenden Medien und inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang mit der PKMO-Lösung bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Nach der Färbung spülen Sie die Zellen dreimal mit vorgewärmten Bildgebungsmedien ab.
Für die letzte Wäsche werden die Zellen 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubiert. Ersetzen Sie nach der Inkubation die letzte Wäsche durch frische, vorgewärmte Bildgebungsmedien mit 20 Millimolaren Hepes.
