Beginnen Sie mit dem Polieren von drei Weidepipetten mit einem Bunsenbrenner, wobei die Durchmesser abnehmen. Als nächstes sterilisieren Sie den Hinterleib einer euthanasierten trächtigen Mausdame mit 70%igem Ethanol. Schneiden Sie die Bauchhöhle von der Schambeinsynthese bis zum Processus xiphoideus des Brustkorbs auf.
Entnehmen Sie nun das Gebärmutterhorn aus der Bauchhöhle und legen Sie es in eine 100-Millimeter-Platte, die mit eiskalter HBSS-Lösung gefüllt ist. Entnehmen und trennen Sie alle Embryonen mit einer feinen Pinzette aus der gewaschenen Gebärmutter. Enthaupten Sie die entnommenen Mäuseembryonen schnell und legen Sie die Köpfe in eine 60-Millimeter-Petrischale, die mit HBSS gefüllt ist.
Setze eine feine Pinzette in die Augenhöhle, um das Gehirn zu halten. Bei einem anderen Paar schälen Sie die Haut und den Schädel, bis das Gehirn sichtbar ist. Entferne das Gehirn aus den Riechkolben des Schädels und drehe es auf den Kopf.
Beobachte den Kortex auf der ventralen Seite und den Hypothalamus auf der dorsalen Seite. Verwenden Sie eine gebogene Pinzette, um die Schicht der Hirnhäute und Blutgefäße zu entfernen, bis das Gehirn weiß und klar erscheint, und trennen Sie den Hypothalamusbereich vom Rest des Gehirns. Schneiden Sie den Hypothalamus in drei bis vier kleine feine Stücke und geben Sie die Stücke mit einer Pipette in ein 15-Milliliter-Röhrchen.
Als nächstes füllst du das Röhrchen mit sechs Millilitern HBSS. Geben Sie dann Enzymmischung 1 hinzu, sobald sich das Gewebe beruhigt und der Überstand entfernt hat. Inkubieren Sie das Röhrchen 15 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad und rühren Sie alle fünf Minuten, um das Gewebe wieder zu suspendieren.
Geben Sie nun 30 Mikroliter Enzymmischung 2 hinzu und dissoziieren Sie das Gewebe, indem Sie mit einer Weidepipette mit großem Durchmesser 10 Mal auf und ab pipettieren. Nach einer weiteren 10-minütigen Inkubation fügen Sie die restlichen 15 Mikroliter Enzyme Mix 2 hinzu. Mit zwei feuerpolierten Pipetten mit abnehmendem Durchmesser wird das Gewebe 10 Mal pipetiert.
Geben Sie sofort 10 Milliliter HBSS mit 0,5 % BSA in das Röhrchen. Dann zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 G für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Saugen Sie den Überstand ab und suspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter HBSS mit 0,5 % BSA.
