Legen Sie zunächst den Chip und den Chipträger in die Chip-Halterung in einer sterilen Gewebekulturschale und legen Sie sie in der Gewebekulturhaube beiseite, während Sie das Chipaktivierungsreagenz vorbereiten. Geben Sie einen Milliliter der CR2-Lösung in die Durchstechflasche mit CR1-Pulver. Die Lösung aus der Durchstechflasche in ein in Aluminiumfolie eingewickeltes 15-Milliliter-Röhrchen überführen.
Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis vier Spülgänge und vier Milliliter CR2 durch die Durchstechflasche CR1 gespült wurden. Verschließen Sie die Durchstechflasche für die letzte Spülung und drehen Sie sie um, um das restliche Pulver zu entfernen. Als nächstes geben Sie sechs Milliliter CR2 in das 15-Milliliter-Röhrchen, das CR1 enthält.
Mischen Sie die endgültige 10-Milliliter-Lösung mit einer Pipette, ohne Blasen zu bilden. Geben Sie mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze 20 Mikroliter CR1-Lösung in den unteren Kanaleinlass des Chips, bis die Lösung beginnt, den unteren Kanalauslass zu verlassen. Geben Sie 50 Mikroliter CR1-Lösung durch den oberen Kanaleinlass, bis die Lösung beginnt, den oberen Kanalauslass zu verlassen.
Legen Sie die Chips dann 15 Minuten lang unter ultraviolettes Licht. Entfernen Sie nach der Belichtung alle CR1-Lösungen aus dem oberen und unteren Kanal. Waschen Sie beide Kanäle mit 100 Mikrolitern CR2-Lösung.
Anschließend zweimal mit 100 Mikrolitern DPBS waschen. Bereiten Sie die extrazellulären Matrixlösungen für den oberen und unteren Kanal des Chips vor. Geben Sie 50 Mikroliter extrazelluläre Matrixlösung in den unteren Kanaleinlass, bis der Tropfen am Auslass erscheint.
Geben Sie dann 50 Mikroliter in den oberen Kanaleinlass, bis der Tropfen am Einlass erscheint. Fügen Sie DPBS in den Chip-Cradle-Behälter ein. Legen Sie den Deckel auf den Teller und inkubieren Sie die Chips über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid-Inkubator.
Spülen Sie am nächsten Tag das Epithel oder den oberen Kanal des Chips mit 100 Mikrolitern vorgewärmtem Chipexpansionsmedium. Spülen Sie dann den Endothel- oder Bodenkanal mit 100 Mikrolitern vorgewärmtem HIMEC-Medium. Nach der Zählung werden 10 Mikroliter HIMECs in den Endothelkanal gegeben.
Geben Sie bei Bedarf organoide Wachstumsmedien oder Chipexpansionsmedien in den Epithelkanal und überprüfen Sie die Aussaatdichte der HIMECs. Als Nächstes wird der Chip in die Chip-Halterung in der Zellkulturschale invertiert, DPBS in das Reservoir in der Chip-Halterung gegeben und der Chip zwei bis drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius platziert, damit sich HIMECs an die Chipmembran anheften können. Nach der Inkubation bringen Sie die Chip-Wiege wieder in eine aufrechte Position.
Waschen Sie den Endothelkanal vorsichtig mit 100 Mikrolitern warmem HIMEC-Medium und den Epithelkanal mit Organoid-Wachstumsmedien oder Chip-Expansionsmedien, wobei das Medium im Kanal belassen wird. Für die Ernte von Enteroiden saugen Sie das Medium vorsichtig ab und waschen Sie die Vertiefungen mit Zellkulturmatrix-Hydrogel mit 500 Mikrolitern warmem DPBS. Geben Sie 250 Mikroliter kalte Zellrückgewinnungslösung in jede Vertiefung und kratzen Sie den Boden jeder Vertiefung mit einer frischen Pipettenspitze auf, um das Zellkulturmatrix-Hydrogel zu unterbrechen.
Die aufgebrochene Zellsuspension wird in ein kaltes 15-Milliliter-Röhrchen auf Eis gegeben und 45 Minuten lang inkubiert. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Suspension und entfernen Sie den Überstand. Geben Sie dann zwei Milliliter warmes enteroides Dissoziationsmedium in das Pellet und legen Sie das Röhrchen in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad.
Geben Sie dann 60 bis 120 Sekunden lang 10 Milliliter kaltes Gewebewaschmittel in das Röhrchen. Zentrifugieren und entfernen Sie dann den Überstand, bevor Sie das Pellet in 200 Mikroliter Chipexpansionsmedium resuspendieren. Dissoziieren Sie die Enteroide mit einer P200-Pipette und geben Sie die Suspension in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.
Zählen Sie die Zellen und passen Sie das Volumen der Chip-Expansionsmedien an, um eine Konzentration von sechs mal 10 auf die sechs Zellen pro Milliliter zu erreichen. Geben Sie dann 30 Mikroliter resuspendierte Zellsuspension in den oberen Kanal des Chips. Nachdem Sie die Chips wieder in die Chip-Halterung zurückgelegt haben, geben Sie DPBS in den Behälter und inkubieren Sie die Chips über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.
Am nächsten Tag wird der Epithelkanal zweimal mit 100 Mikrolitern Chipexpansionsmedium und der Endothelkanal mit 100 Mikrolitern HIMEC-Medien gespült. Geben Sie dann zwei Milliliter des Chipexpansionsmediums in den oberen Kanaleinlassbehälter und 300 Mikroliter in den oberen Kanalauslassbehälter. Geben Sie zwei Milliliter des HIMEC-Mediums in den Einlassbehälter des unteren Kanals und 300 Mikroliter in den Auslassbehälter des unteren Kanals.
Die Schoten grundieren und die Chips in die Schoten geben. Fügen Sie dann die Pods zum Kulturmodul hinzu. Stellen Sie eine Durchflussrate von 30 Mikrolitern pro Stunde ein und starten Sie den Zyklus.
Die Darmepithelzellen, die mit dem Darm des Neugeborenen auf einem Chip gezüchtet wurden, bildeten eine konfluierende Zellmonoschicht und entwickelten sich anschließend zu einer reifen dreidimensionalen zottenartigen Struktur. Die Zugabe eines dysbiotischen Mikrobioms eines Neugeborenen mit schwerer nekrotisierender Enterokolitis in den Neugeborenendarm in einem Chipmodell zeigte eine erhöhte Expression von TNF-alpha im Vergleich zur Kontrolle.
