Beginnen Sie mit der Trypsinisierung der menschlichen mesenchymalen Stammzellen, um eine Zellsuspension herzustellen. Als nächstes aliquotieren Sie die Zellsuspension in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen, um 10 Konstrukte zu erstellen. Nachdem Sie die Suspension drei Minuten lang bei 220 g zentrifugiert haben, verwenden Sie eine Vakuumpumpe, um den Überstand zu entfernen.
Legen Sie nun das Zellpellet auf Eis. Als nächstes bringen Sie die Thiol-modifizierte Hyaluronsäure, den Thiol-reaktiven Vernetzer, das Polyethylenglykoldiacrylat und die entgasten Wasserflaschen auf Raumtemperatur. Verwenden Sie unter sterilen Bedingungen eine mit Nadeln bestückte Spritze, um einen Milliliter entgastes Wasser in die Flasche mit Hyaluronsäure zu geben.
Sprühen Sie die Lösung vor und erhitzen Sie sie gelegentlich auf 37 Grad Celsius, bis sie klar wird. Geben Sie dann die Lösung auf Eis. Unter sterilen Bedingungen 5 Milliliter entgastes Wasser in die Vernetzerflasche geben.
Lösen Sie sich auf, indem Sie es wiederholt umkehren, bevor Sie es auf Eis legen. Geben Sie nun 120 Mikroliter der gelösten Hyaluronsäurelösung in das aliquotierte Zellpellet und resuspendieren Sie das Zellpellet, indem Sie die Lösung hin und her pipettieren. Geben Sie 30 Mikroliter der gelösten Vernetzerlösung in das Röhrchen mit dem resuspendierten Zellpellet.
Stellen Sie sicher, dass Sie richtig mischen, indem Sie auf das Röhrchen klopfen. Nach dem Mischen die Lösung kurz herunterschleudern. Geben Sie 15 Mikroliter der kombinierten Lösung auf eine paraffinbeschichtete 24-Well-Platte.
Bei 37 Grad Celsius 30 Minuten erstarren lassen. Für die In-vitro-Differenzierung werden 0,5 Milliliter chondrogenes Differenzierungsmedium zu den zellsitzenden Hydrogelen gegeben. Wechseln Sie nach drei Wochen auf das hypertrophe Differenzierungsmedium und fügen Sie 0,5 Milliliter pro Vertiefung hinzu.
Die chondrogene Differenzierung führte zu sulfatierten Glykosaminoglykanen in der kollagenpositiven extrazellulären Matrix vom Typ 2 sowohl in der Hyaluronsäure oder HA als auch in den Kollagenkonstrukten. Allerdings war die Verteilung in den Hyaluronsäure-Konstrukten homogener. Die Kollagenkonstrukte zeigten periphere Zellen mit heterogener Morphologie.
Die durchschnittliche Rundheit der Zellen in den HA-Konstrukten war höher als in den Kollagenkonstrukten. Kalziumablagerungen wurden nach fünf Wochen an den äußeren Rändern beider Konstrukte nachgewiesen. In den in vivo HA-Konstrukten wurden alle Implantate in subkutanen Taschen miteinander verbunden und bildeten integriertes Knochengewebe.
40% der in vivo Kollagenkonstrukte waren unabhängig. Acht Wochen nach der Implantation bildete sich in den äußeren Regionen beider in vivo Konstrukte Osteoidgewebe mit lamellärer Morphologie. Knorpelverlust wurde auch im HA-Konstrukt beobachtet.
Mehrere in vivo HA-Konstrukte schienen integriertes Knochengewebe zu bilden, was durch die Verbindung zum Knochengewebe und das Vorhandensein von Gelenkfasergewebe angezeigt wird. Während 40% der Kollagenkonstrukte vereinigt waren, existierten die restlichen Konstrukte getrennt oder waren nur ohne knöcherne Gewebeverbindungen verbunden. Beide Konstrukte zeigten positiv markierte Gefäße im Knochenmark, und der innere Knorpel war von mehrkernigen Osteoklastenzellen umgeben.
Das Mineral wurde sowohl bei Konstrukten mit höherem Mineralvolumen als auch bei HA-Konstrukten aufgrund ihrer größeren Größe in der äußeren Osteoidregion abgelagert.
