Beginnen Sie mit der Extraktion der genomischen DNA aus den Wildtyp- und Agrobacterium-infizierten Bambusblättern. Amplifizieren Sie die genomische DNA, die die Zielstelle der Zielgene enthält, aus Wildtyp- und Agrobacterium-infizierten Bambusblättern unter Verwendung der folgenden PCR-Bedingungen. Nach der PCR wird der Enzymverdau der Endonuklease durchgeführt, indem eine Reaktionsmischung hergestellt wird, die einen Mikroliter Age-1, ein Mikrogramm PCR-Produkte und fünf Mikroliter 10X-Puffer enthält.
Dann wird Wasser auf ein Endvolumen von 50 Mikrolitern gegeben. Die Aufschlussmischung bei 37 Grad Celsius für eine Stunde inkubieren. Analysieren Sie mithilfe der Gelelektrophorese den Anteil der verdauten DNA-Fragmente.
Vergleichen Sie die verdauten Fragmente aus Wildtyp- und Agrobacterium-infizierten Proben, um die Effizienz der Geneditierung zu beurteilen. Setzen Sie die Bambussämlinge hohen Lichtintensitäten aus, um die Menge des absorbierten Lichtquantums und die Aktivierung des Lichtschutzsystems der Blätter zu erhöhen. Schalten Sie als Nächstes das IMAGING-PAM-Fluorometer ein und stellen Sie die aktinische Lichtintensität ein, um die In-vivo-Photosystem-II-Chlorophyllfluoreszenz von Bambusblättern zu messen.
Die rote Beta-Lane-Farbe, die durch das Ruby-Gen erzeugt wird, deutet auf eine erfolgreiche Agrobacterium-vermittelte Genexpression in Bambusblättern hin. Von den vier Agrobacterium-Stämmen verursachte der Stamm GV3101 die signifikanteste Beta-Lane-Akkumulation in infizierten Bambusblättern. Nach einer Infektion mit den CRISPR-Cas9-Konstrukten und High-Light-Behandlungen zeigten bestimmte Bereiche der Blattspreiten niedrigere nicht-photochemische Quenching-Werte.
Darüber hinaus bestätigte die Enzymverdauung und Sequenzierungsanalyse die erfolgreiche Mutation des PeVDE-Gens in den editierten Regionen. Die Ergebnisse der Sanger-Sequenzierung des PeVDE-Fragments nach der Editierung mit sgRNA1 und sgRNA2 zeigten die Deletion eines langen Fragments im PeVDE-Gen. Nach 30 Tagen Agrobacterium-Infektion wiesen die Blattbereiche, die mit sgRNAs sowohl für PeVDE als auch für PeCCR5 transfiziert wurden, niedrigere nicht-photochemische Quenching-Werte auf.
