Nehmen Sie zunächst 10 Milliliter der Kieselalgen-Wasserprobe in ein Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 13, 400 g. Mit einer Pipettenpistole 9,8 Milliliter des Überstandes vorsichtig entsorgen.
Anschließend werden 200 Mikroliter der angereicherten Kieselalgen-Wasserprobe in ein Zwei-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt. Als nächstes entnehmen Sie 0,5 Gramm Lungenrandgewebe aus einem ertrunkenen menschlichen Körper. Schneiden Sie das Lungengewebe mit einer Schere durch, bis es schlammig wird.
Für die DNA-Extraktion sowohl aus Kieselalgen- als auch aus Lungenproben fügen Sie zunächst Glasperlen zu beiden Proben hinzu. Nachdem Sie die Proben gut gemischt haben, geben Sie 40 Mikroliter Proteinase K in die Röhrchen. Nach einer 15-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur werden 200 Mikroliter Bindepuffer in beide Röhrchen gegeben.
Mischen Sie die Proben sofort vier Minuten lang mit einem Vortex-Mischer. Anschließend legen Sie die Röhrchen für 10 Minuten in ein Wasserbad bei 70 Grad Celsius. bis die Lösung klar ist.
Als nächstes wird die klare Lösung mit Flockungsmittelniederschlag überführt. in eine drei Zentimeter lange Adsorptionskolonne, die mit Siliziummatrix gefüllt ist. Die Säule wird 30 Sekunden lang bei 8.000 g zentrifugiert.
Entsorgen Sie dann die Abfallflüssigkeit im Sammelröhrchen und setzen Sie die Säule wieder in das Sammelröhrchen ein. Geben Sie nun 500 Mikroliter des Inhibitorentfernungspuffers in die Säule und zentrifugieren Sie 30 Sekunden lang bei 13.400 g. Nachdem Sie die Abfallflüssigkeit entsorgt haben, geben Sie 700 Mikroliter des Waschpuffers in die Säule und zentrifugieren Sie erneut.
Nachdem Sie die Abfallflüssigkeit entsorgt haben, setzen Sie die Adsorptionssäule wieder in das leere Auffangröhrchen ein. Zentrifugieren Sie die Säule zwei Minuten lang bei 14.500 g, um so viel Waschpuffer wie möglich zu entfernen. Nehmen Sie nun die Säule heraus und legen Sie sie in ein sauberes Zentrifugenröhrchen.
Geben Sie 100 Mikroliter Elutionspuffer in den mittleren Teil der Adsorptionsmembran. Die Säule wird nach einer fünfminütigen Inkubation bei Raumtemperatur eine Minute lang bei 13.400 g zentrifugiert. Die im Sammelröhrchen erhaltene Lösung wird vor dem erneuten Zentrifugieren wieder in die Adsorptionskolonne überführt.
Lagern Sie die eluierte Diatomeen-DNA für die spätere Verwendung bei zwei bis acht Grad Celsius. Die Agarose-Gelelektrophorese zeigte Kieselalgen-DNA-Banden zwischen 250 und 500 BP sowohl in Wasserproben als auch in Geweben nach PCR-Amplifikation.
