Füllen Sie zunächst jede Nadel mit fünf Mikrolitern Alexa Fluor-markierter GFP-Nanobody-Lösung. Legen Sie ein 25 x 25 Millimeter großes Deckglas auf eine Glasträgeroberfläche. Pipettieren Sie 40 Mikroliter Halogenkohlenstofföl auf den Objektträger und verteilen Sie es entlang des Umfangs des Deckglases.
Positionieren Sie die Nadelspitze unter dem Injektionsmikroskop gegen den in Öl getauchten Rand des Deckglases. Stellen Sie den Einspritzluftdruck der PicoPump entsprechend ein. Ersetzen Sie den leeren Objektträger durch den vorbereiteten Drosophila-Objektträger.
Setzen Sie die Spitze der Injektionsnadel senkrecht zur vorderen und hinteren Achse des Embryos. Verwenden Sie den Manipulator der XY-Stufe, um die Embryonen zur Nadel zu führen, bis die Spitze die Mitte des Dotters erreicht, und pumpen Sie zwei- bis dreimal, um Antikörper in das Eigelb zu infundieren. Mit dem Manipulator der XY-Stufe können Sie die Embryonen nach der Injektion von der Nadel weglenken und zum nächsten Embryo übergehen.
Lassen Sie die Embryonen bei 25 Grad Celsius inkubieren, bis sie das gewünschte Entwicklungsstadium erreicht haben. Identifizieren Sie die Embryonen nach der Inkubation unter einer Low-Power-Linse mit Hellfeldbeleuchtung und wechseln Sie zu einer 40X- oder 63X-Linse für hochauflösende fluoreszierende Live-Bildgebung. Nach der Injektion verbessert sich das Signal-Rausch-Verhältnis des Notch-Rezeptors signifikant, vergleichbar mit der Signalqualität der Immunfluoreszenz.
Darüber hinaus ermöglichte die Antikörperinjektion die zeitliche Charakterisierung der Kerblokalisierung in 45-Sekunden-Intervallen ohne einen offensichtlichen Verlust der Signalintensität über ein fünfminütiges Bildgebungsfenster. Die Live-Bildgebung von embryonalem Phosphotyrosin zeigte, dass die Tyrosinphosphorylierung an den trizellulären Verbindungen stark angereichert ist. Zusätzlich wurde eine neue zweite Population des Phosphotyrosin-Signals unterhalb des Zentrums der apikalen Membran beobachtet.
Die zweifarbige Bildgebung zeigte, dass sich diese Population des Phosphotyrosin-Signals in der Nähe des medialen Myosins befindet. Darüber hinaus zeigte die mediale Population von Phosphotyrosin ähnliche pulsierende Koaleszenz- und Dissipationsmuster, wie sie für mediales Myosin gezeigt wurden.
