Zu Beginn säen Sie DAKIKI-Zellen in einer Sechs-Well-Platte mit einer Dichte von sechs Millionen Zellen pro Well. Richten Sie die verschiedenen Versuchsgruppen ein und inkubieren Sie die Platten nach der entsprechenden Behandlung auf der Grundlage der Gruppierungsmethode 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Extrahieren Sie die Gesamt-RNA aus den DAKIKI-Zellen und befolgen Sie dabei die Anweisungen im Gesamt-RNA-Extraktionskit.
Entnehmen Sie aus jeder Probengruppe einen Mikroliter der extrahierten RNA, um deren Konzentration zu messen. Transkribieren Sie ein Mikrogramm Gesamt-RNA aus jeder Probe in komplementäre DNA, indem Sie den Anweisungen des Kits folgen. Führen Sie eine reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion oder RT-PCR-Amplifikation durch, um die Expression jedes Gens nachzuweisen.
Für das Western Blot nach der ersten 24-stündigen Inkubation entnehmen Sie die Zellen jeder Gruppe. Geben Sie den gesammelten Zellen eine angemessene Menge Zelllyselösung hinzu, bevor Sie sie 30 Minuten lang auf Eis inkubieren. Zentrifugieren Sie die Proben bei 13.500 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und sammeln Sie den Überstand für die weitere Analyse.
Wirbeln Sie die Proteinproben mit 5X SDS-PAGE Loading Buffer im Verhältnis vier zu eins vor und erhitzen Sie die gemischten Proben fünf Minuten lang bei 100 Grad Celsius, um das Protein vor der Elektrophorese zu denaturieren. Sobald der Lauf abgeschlossen ist, übertragen Sie das Gel auf die PVDF-Membranen. Um die Membran zu verstopfen, inkubieren Sie sie zwei Stunden lang bei Raumtemperatur in 5%iger fettfreier Milch.
Inkubieren Sie dann die Membran 24 Stunden lang mit den entsprechenden Primärantikörpern, während Sie Beta-Aktin-Antikörper als interne Kontrolle verwenden. Anschließend werden die Membranen zwei Stunden lang mit dem entsprechenden sekundären Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper bei Raumtemperatur inkubiert. Behandeln Sie schließlich die Membranen mit einer angemessenen Menge an verbesserter Chemolumineszenz-Arbeitslösung für den Nachweis von Proteinbanden.
Die quantitativen RT-PCR-Ergebnisse zeigten, dass die relative mRNA-Expression von C1GalT1 und Cosmc in DAKIKI-Zellen in der Modellgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe herunterreguliert war. Dioscin regulierte die relative mRNA beider unterschiedlicher Grade im Vergleich zur Modellgruppe hoch. Die Western-Blotting-Ergebnisse zeigten auch, dass die Proteinexpression von C1GalT1 und Cosmc in DAKIKI-Zellen in der Modellgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe abnahm.
Die Proteinexpression war nach Dioszin-Intervention hochreguliert.
