Für die Paraffineinbettung von Zellen stellen Sie die Paraffinmaschine auf 58 Grad Celsius ein. Übertragen Sie die Membraneinsätze mit einer Zange in saubere Vertiefungen einer sterilen 24-Well-Platte. Fügen Sie 500 Mikroliter 37%iges gepuffertes Formalin und PBS über den Filter und einen Milliliter unter den Filter hinzu.
Schließen Sie den Deckel und lassen Sie den Teller zwei Stunden lang in einem Abzug. Sobald sich die Lamina propria vom Membraneinsatz gelöst hat, wird die Darmschleimhaut in ein Becherglas mit 25 Millilitern 35%igem Ethanol überführt und 10 Minuten lang inkubiert. Nach der Dehydratisierung bei steigenden Ethanolkonzentrationen werden die Proben für 10 bis 20 Minuten in 50 Milliliter Xylol oder ein histologisches Reinigungsmittel gelegt.
Sobald die Proben durchsichtig sind, legen Sie sie in einen Metallgewebekassettenhalter und tauchen Sie sie in flüssiges Paraffin in einer beheizten Maschine. Nach 45 Minuten mit einem Mikrotom vier Mikrometerschnitte schneiden. Legen Sie den geschnittenen Teil auf die Objektträger und trocknen Sie sie 24 Stunden lang im Ofen bei 37 Grad Celsius.
Ein akzeptables 3-D-Darmäquivalent-Mukosamodell besteht aus Caco-2-Zellen, die in einer engen und regelmäßigen Monoschicht über der extrazellulären Matrix-reichen Lamina propria gebildet sind. Zu den inakzeptablen Modellen gehören solche, die übermäßiges Wachstum, desorganisierte Epithelschichten, Fehlbildungen oder mangelnde Bildung von Epithelschichten aufweisen. Die proinflammatorische Wirkung von Weizenprotein mit hohem Glutengehalt störte die zelluläre Monoschicht und reduzierte die Dicke der Epithelschicht im Vergleich zur Kontrollgruppe.
Der Gehalt an Occludin-Protein war in der Kontrollgruppe signifikant höher als in der Gruppe, die Glutenprotein ausgesetzt war. CD14- und CD11b-Färbungen von U937-Monozyten zeigten, dass Weizenprotein mit hohem Glutengehalt die Monozyten aktivierte und ihre Migration und Differenzierung in Makrophagen induzierte. Unter der Lipopolysaccharid-Herausforderung erhöhten Caco-2-Zellen die Schleimproduktion und die Freisetzung des Entzündungsmarkers Midkin.
